项目文章丨单细胞转录组揭示小鼠肌少症相关的潜在分子途径
2022 年 9 月，来自云南省第一人民医院骨外科的研究团队在 J Cachexia Sarcopenia Muscle 杂志上合作发表了题名为“Single-cell RNA-seq reveals interferon-induced guanylate-binding proteins are linked with sarcopenia”的研究论文，本研究利用单细胞 scRNA-seq 在构建的肌肉减少症小鼠模型中进行检测，提供了骨骼肌的详细单细胞图谱。研究表明，内皮细胞在肌少症中发挥重要作用，且存在不同的内皮细胞亚型，肌少症的内皮细胞在表达层面、富集层面都与正常的内皮细胞存在差异，通过表达、富集和细胞互作等分析，表明内皮细胞可能通过干扰素诱导的 Gbp 信号通路在肌肉减少症，而在临床样本中也发现了部分患者内皮细胞 GBP 基因的异常。因此，干扰素-GBP 相互作用可能是治疗年龄相关性肌肉减少症的一个有希望的新靶点。该研究中单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】J Cachexia Sarcopenia Muscle
【发布时间】2022年9月
【影响因子】12.063
【检测技术】10x Genomics 单细胞转录组测序
科学问题
肌肉减少症是一种描述为骨骼肌质量和/或肌肉力量进行性下降的病症。由于年龄是这种综合征的主要风险因素之一，因此肌少症越来越被认为是老龄化人口面临的一项重大公共卫生挑战，这对医疗保健系统构成了相当大的经济负担。因此，迫切需要了解这种疾病并开发新的预防和治疗方法。
许多研究努力了解驱动肌少症的机制，目前已观察到年龄相关的变化与肌少症的发病机制有关，然而，这些研究中的大多数使用微阵列芯片或 bulk RNA-seq，这只能反映各种细胞类型混合物的平均基因表达。虽然有文章报道，使用单核测序来研究肌肉细胞组成中与年龄相关的变化，然而肌少症仍缺乏单细胞水平的直接研究。
技术路线
主要研究结果
1. 小鼠肌少症模型的构建
根据文献报道，建立了小鼠 P6DX 肌少症模型（图1 A），对体重、肌肉细胞计数、横截面纤维面积、骨骼肌的肌肉结构等表型进行评估，结果都表明成功建立了肌少症模型。（图1 B-F）。
2. 小鼠骨骼肌中不同的细胞组成
对三组（对照组、假手术组、肌少症组）的小鼠骨骼肌样本进行了 scRNA-seq。首先建立了肌少症的骨骼肌单细胞图谱，根据细胞标志物进行细胞类型鉴定（图2 A-C）。根据细胞占比分析，则发现内皮 1 和内皮 2 是最丰富的细胞类型，且来源显示出组间异质性（图2 B-D），这表明来自肌少症的内皮细胞具有与稳态状态内皮所不同的转录组谱。
3. 特异性内皮细胞的异质性
内皮细胞来源显示出组间异质性，表明内皮细胞可能在肌少症中起重要作用。随后观察肌少症组的内皮细胞 EC1 与对照组的内皮细胞 EC2 不同，这表明内皮细胞可能在肌肉减少症中起重要作用。随后比较了肌少症组的内皮细胞 EC1 和对照组内皮细胞 EC2 的差异（图3 A-B），根据差异分析，发现干扰素相关基因和 Gbps 相关的基因在内皮的组间存在较大差异，因此说明干扰素诱导的 Gbps 可能在肌少症的发病过程中具有新的作用。
随后进行 GSEA 分析以研究两种内皮各自的富集通路。在 Reactome 通路中，干扰素信号相关通路在内皮 2 中属于最高的阳性富集通路，细胞因子相关通路也呈正态的富集（图3 C）。在 GO 功能中，细胞因子介导的通路、细胞对细胞因子刺激的反应和对干扰素 γ 的反应是高度富集的功能（图3 C）。而基因表达结果也显示，干扰素信号通路相关的基因在内皮 2 中显着高表达（图3 D）。
4. 肌少症中的细胞相互作用
为了研究肌少症中细胞通讯是否受到干扰，使用 CellChat 推断细胞的相互作用，并比较三个组之间的相互作用网络。使用 Endothelial_major 代替不同组中主要的内皮细胞（对照组的 EC1，实验组的 EC2）。总体而言，对照组中推断出更多的细胞相互作用，而在大多数细胞类型中，实验组的相互作用较少且作用强度较低（图4 A-E）。这些结果共同表明肌少症中细胞的通讯受到损害，并可能归因于肌少症的发生。
5. 小鼠和人类肌少症活检中 Gbp2 的异常表达
从 scRNA-seq 数据中，观察到实验组内皮细胞中 Gbp2 的异常高表达，随后使用不同的实验验证。首先通过蛋白质印迹评估了 Gbp2 的表达（图5 A-B），与其它两组相比，实验组中 Gbp2 的蛋白质显著的高表达。随后也使用免疫荧光进一步检查了 Gbp2 的表达，在实验组的内皮细胞中广泛的检测到 Gpb2 的表达，但在对照组中大多不存在Gbp2 的表达，且实验组中 Cd31 和 Gbp2 存在共定位的比例显著高于其它两组（图5 C）。
随后也在人类肌少症患者中通过免疫荧光进行验证，总体而言，发现 27.5%（40 名中的 11 名）患者在表现出显著的 GBP2 表达，且发现 CD31 和 GBP2 的共定位比例也显著高于对照组。
6. GBP2 的过表达导致内皮细胞血管形成受损
血管形成测定是体外血管生成评估的一种方法。在本研究中，构建了 HUVEC-GBP2 过表达细胞，通过蛋白质印迹验证 GBP2 的过表达（图6 A-B）。在血管形成测定中，发现 GBP2 过表达组的血管形成能力显著降低，没有观察到明显的细胞聚集形成血管，而在对照组中发现了明显的血管形成（图6 C）。
研究结论
本研究利用单细胞 scRNA-seq 在肌肉减少症小鼠模型中进行检测，提供了骨骼肌详细的单细胞图谱。结果表明，内皮细胞存在不同的亚型，且在肌少症中发挥重要作用，肌少症的内皮细胞在转录方面、功能富集方面都与正常的内皮细胞存在差异，通过细胞互作分析，表明肌少症的内皮细胞可能通过干扰素诱导的 Gbp 信号通路发挥作用，而在临床样本中也发现了部分患者内皮细胞 GBP 基因的异常。因此，干扰素-GBP 相互作用可能是治疗肌少症的一个潜在治疗靶点。
参考文献：
Peng Z, Zhang R, Kuang X, et al. Single‐cell RNA‐seq reveals interferon‐induced guanylate‐binding proteins are linked with sarcopenia[J]. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle, 2022.
