单细胞直扩基因检测新突破 -- 数字PCR筛查SMA男性2+0型携带者

临床遗传学领域经典杂志《Clinical Genetics 》杂志发表郑大一附院遗传与产前诊断中心题为“Detection of male 2+0 and 1+0 carriers for spinal muscular atrophy by digital PCR”的论著。本研究成果由郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心与上海小海龟科技有限公司合作完成，郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心郜珊珊博士为第一作者，孔祥东教授为通讯作者。 脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种携带频率很高的常染色体隐性疾病，人群发病率1/6000～1/10000，其临床表现为弛缓性麻痹和肌萎缩，SMA尚无特效治疗措施,进行产前基因诊断可以避免，携带致病基因的胎儿出生，产前基因诊断的前提是家族中先证者和携带者的诊断必须明确。鉴于SMA的疾病严重性和人群高携带率建议所有夫妇，无论种族或民族，都进行SMA携带者筛查。但是，目前只能检测1+0型携带者，2+0型携带者的检测仍然具有挑战性。该篇文章应用数字聚合酶链式反应(dPCR)技术开发了一种新型的检测男性携带者(DMC)的方法，特别是那些2+0基因型的携带者。 在基因型1+1的正常人的体细胞中，SMN1基因的两个拷贝分别位于两条5号同源染色体上。2+0型携带者的SMN1基因两个拷贝都位于同一条染色体上。1+0型携带者的体细胞中一条5号染色体有1份SMN1，另一条染色体上缺失。在精子形成过程中，染色体发生减数分裂，同源染色体分别分配到不同的精子细胞内（图A，B）。基于dPCR平台“独立分割”的原理，尤其是基于微流控芯片的“固态油隔水”技术，不仅可以分割独立的核酸分子，还可以实现把精子细胞进行单分散（图C）。精子细胞在独立的反应腔室内进行裂解，扩增，通过特异性引物和探针可以检测到SMN1基因的特异性片段。SMN1基因的FAM，内参基因 的HEX，SMN2基因 的ROX荧光信号分别以蓝色、绿色和黄色显示。在1+1基因型的情况下，每个阳性腔室中一个完整的精子细胞，会同时出现三种信号。对于2+0或1+0基因型，一半的阳性腔室有三种信号(蓝色，绿色和黄色)，另一半的阳性腔室只有两种信号(绿色和黄色)(图D)。

在39份精液样本中评估了DMC的临床效用。对111名男性及其家庭成员的基因组DNA进行了多重连接依赖探针扩增(MLPA)和系谱分析。DMC在21名、1名和8名受试者中鉴定出1+1、2+1和1+0基因型。重要的是，7名男性被确定为2+0携带者，而2名男性被排除在2+0携带者之外。DMC的结果与MLPA和系谱分析的结果一致。DMC为确定2+0和1+0基因型提供了一种价格低而准确的方法。 更多文献解读，实验技巧可在“优宁维分子生物学”进行查询学习

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