肝细胞癌免疫治疗的侵入性及非侵入性生物标志物：现状及展望

免疫治疗问世以后，晚期肝细胞癌（HCC）的治疗观点发生了深刻变化。与索拉非尼相比，免疫治疗缓解者生存率提高，但只有1/3的患者从中显著获益。由于肿瘤微环境在免疫治疗缓解中发挥核心作用，HCC治疗的未来目标应该是确定易于在临床实践中使用的肝组织状况的替代指标。因此，寻找准确预测预后的生物标志物将是近期HCC治疗管理的热点。了解免疫治疗耐药机制可能会扩大受益于免疫治疗的患者群体，并且帮助研究人员找到新的组合方案来改善患者预后。本文综述了目前与免疫检查点抑制剂治疗相关的预后非侵入性生物标志物的相关知识，重点为血清学标记物和肠道微生物群。

——前 言——

HCC是高度异质性的癌种，在既往的化疗时代，鲜有药物能够对HCC产生疗效。靶向治疗时代，以索拉非尼为代表的小分子TKI药物，成为HCC治疗的标准方案，但整体患者响应率较低，耐药性较高，患者整体的OS提升效果有限。而在免疫治疗时代，以T+A、D+T为代表的免疫联合靶向及双免疫联合方案，成为新的晚期HCC一线治疗标准。无论是患者客观响应率及OS的提升，都表现不俗。但依然有较大的提升空间。如何有效的筛选免疫获益型的HCC患者，特别是非侵入性的Biomarker的探索 ，是进一步提升患者响应率及OS的发展方向。

HCC免疫治疗的新型Biomarker

——侵入性Biomarker——

肿瘤免疫治疗相关的生物标志物谱，比较常用的还是TMB、dMMR、PD-L1，也是泛肿瘤普遍监测的生物标记物。

细胞程序性死亡 - 配体1（PD-L1）

PD-L1表达作为PD-1单抗直接的作用靶点，是肿瘤组织上的一个重要标志物，也是目前研究最为深入的标志物，但关于PD-L1表达的预测价值，在不同瘤种中，研究结论不一。由此引发了对分子生物标志物、循环生物标志物和影像生物标志物的探索。

《中国非小细胞肺癌PD-L1表达检测临床病理专家共识》

目前常采用的平台技术和非小细胞肺癌中不同免疫检查点抑制剂的Cut-off值如上图所示。SP263被欧盟批准用于非小细胞肺癌帕博利珠单抗药物一线和二线以及Ⅲ期患者度伐利尤单抗药物的伴随诊断、纳武利尤单抗药物二线的补充诊断；FDA批准其用于非小细胞肺癌Ⅲ期患者度伐利尤单抗药物的补充诊断；到目前为止，22C3PD-L1抗体、SP263PD-L1抗体以及 22C3、28-8 PD-L1检测、SP142PD-L1都已经获得NMPA获批。随着试验的不断更迭，PD-L1的检测指标也由TPS向CPS转变。

TPS

• 作为FDA批准的伴随诊断和补充诊断，PD-L1检测关注焦点是位于肿瘤细胞的PD-L1表达水平，即 肿瘤细胞阳性比例分数（TumorProportion Score, TPS)。

  
  

CPS

• 除了肿瘤细胞表达PD-L1之外，淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞以及间质细胞也会有PD-L1表达，从而抑制免疫功能。因此，需要引入另一个PD-L1表达概念：联合阳性分数（CombinedPositive Score，CPS）

  
  

帕博利珠单抗PD-L1cut-off值

据报道，PD-L1在HCC中的表达普遍较低（约占肿瘤细胞的10%），并且与复发和更短的OS相关。但在HCC领域，应用有限。

肿瘤突变负荷（TumorMutation Burden, TMB）

预测新抗原数量的指标,突变负荷提高会产生更多MHC结合和免疫原性肽，TMB被定义为每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。即外显子区域上平均1Mb碱基出现的体细胞突变（非同义突变）的数量。    

TMB与ICIs ORR的相关行 

肿瘤突变负荷（TMB）作为一个潜在的生物标志物而出现。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb~超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子（WES）测序方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。

TMB阈值

然而，与PD-L1表达的情况一样，TMB测定缺乏标准化阈值，量化方法也存在差异。因此，应谨慎解释TMB的临床价值。

2017年，FDA首次基于肿瘤生物标志物状态（具有标志意义），批准了pembrolizumab用于治疗微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)不可切除/转移性实体肿瘤的患者。

从某种程度上来说，TMB的上游影响因素就是MSI，而MSI的原因又在与DNA复制时出现了错误，主要是修复蛋白MMR出现看功能障碍，因此，我们常见到MSI-H/dMMR同时成为不同癌种，尤其是结直肠癌的检验指标。接下来，我们具体介绍各个名词概念。

在介绍MSI之前，首先我们得了解微卫星等概念。

微卫星（Microsatellite，MS）

• 基因组中的一类短串联重复DNA序列，一般由1-6个核苷酸组成，呈串联重复排列。由于其核心重复单元重复次数差异，微卫星具有群体多态性。

微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）(

• 指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星的重复单位没有插入或缺失的改变，该微卫星是稳定的状态。i

微卫星不稳定（Microsatellite Instability，MSI）(t

• 与正常组织相比，肿瘤中某个微卫星位点由于重复单元的插入或缺失而出现新的微卫星等位基因的现象。

• 原因：人体细胞内微卫星错配修复系统(MMR)功能失常，导致DNA复制发 生错误，导致肿瘤部位遗传物质发生改变。

• 结果：MSI会使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化，最终导致癌症的发生。根据不同的稳定程度，分为高度微卫星不稳定（MSI-H）、中度微卫星不稳定（MSI-M）、低度微卫星不稳定（MSI-L）。

  
  

dMMR与免疫治疗

错配修复（Mismatch Repair ，MMR）

• MMR是重要的DNA修复机制，是识别及修复在DNA复制或重组过程中，可能产生的碱基错误插入、缺失和错配以及其他形式的DNA损伤，维持基因组稳定性。

• 在人体内，7个MMR蛋白（MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2）按照工作顺序进行DNA  的修复

错配修复缺陷（Mismatch Repair Deficiency，dMMR）

• MMR缺陷，即DNA错配修复功能缺陷，MMR蛋白表达阴性。MMR功能缺陷与多种肿瘤相关，尤其是与遗传学非息肉性大肠癌、部分散发性大肠癌及Lynch综合征。i

  
  

dMMR的表达情况 

虽然MSI-H病例在整个肿瘤谱中发生的频率较低，但它们在结直肠癌(CRC)和子宫内膜癌中最为普遍，频率约为15%（在转移性结直肠癌中为5%）。

MSI/MMR监测

为了确定MSI/MMR状态，通常首先使用IHC对四种MMR蛋白，MSH2、MSH6、MLH1和PMS2进行评估，如果这些蛋白没有通过IHC检测到，CRC被归类为错配修复缺陷(dMMR)。由于MMR在DNA复制过程中的功能错误，可以导致MSI。

MSI/MMR的检测方法

针对PD-L1、TMB、MSI-H/dMMR等标志物进行了相关性分析， 采用PD-L1 IHC CDx测定PD-L1、FoundationOne®CDx测定TMB、FoundationOne®CGP测定MSI。

PD-L1cut-off值：

    非小细胞肺癌（TPS）≥ 1）

    食管鳞状细胞癌（CPS）≥10)

     尿路上皮癌（CPS）≥10)

     宫颈癌（CPS）≥10)

     胃/胃食管腺癌（CSP）≥1)

     头颈部鳞状细胞癌（CSP）≥1)

     乳腺癌(IC)≥1）

TMB/MSI cut-off值：

       ≥10个mutations/Mb

       MSI+ = MSI-H

图16.PD-L1/MSI/MMR的关系

测定了22592例多癌种患者中PD-L1/TMB/MSI的关系，两个以上Biomarker阳性的患者人群数量占比较高，也体现出联合检测指标在临床患者中的重要性。不同肿瘤中PD-L1阳性、TMB-H、MSI-H扩增的发生率差异大，当这些标志物进行联合检测，可有效筛查出免疫治疗潜在获益人群。然而，这些相对可靠的生物标志物在实际临床应用中仍面临挑战，如在不同平台间检测PD-L1表达水平的一致性欠佳，TMB检测方法、阈值及算法仍无统一标准，MSI-H在泛癌症中发生率并不高等。此外，一些新的潜在生物标记物，如HLA分型、TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）、肠道微生物等仍需更多的研究证据支持。

——非侵入性Biomarker——

研究表明，TGF-β在TME内的免疫抑制和肿瘤免疫逃避中起着核心作用。在HCC中，TGF-β信号与耗竭的免疫信号之间存在强烈的相关性。在一项II期试验中，对29例接受pembrolizumab治疗的不可切除肝癌患者的几种代表性循环生物标志物进行了分析，结果表明，基线血浆TGF-β水平<200 pg/mL是更好的OS和PFS的有效预测因子。

一些可溶性免疫检查点相关蛋白最近被证明在各种癌症类型中具有很好的预测价值。如PD-L1的外泌体，在一项研究中，循环外泌体PD-L1水平的增加幅度可以区分临床应答者和无应答者。此外，可溶性PD-L1（sPD-L1）与NSCLC患者的免疫治疗反应相关，而关于HCC患者缺乏相关数据，需要进一步研究。

外周血中的循环免疫细胞已被广泛评估为预测性生物标记物。在tremelimumab对HCC患者与局部区域治疗的联合试验中，发现在基线检查时，外周血单个核细胞中CD4+PD-1+细胞的频率在对治疗有反应的患者中高于无反应的患者。此外，在16例接受nivolumab治疗的肝癌患者中，观察到基线水平较低的外周血PD-1+B细胞阳性和PD-L1+单核细胞阳性与疾病控制相关。

循环肿瘤DNA（ctDNA）可以预测几种肿瘤对ICI治疗的反应。然而，一项使用ctDNA分析晚期HCC突变情况的研究报告，WNT通路相关突变与ICI治疗后的临床结果无关，表明需要进一步研究以确定ctDNA是否确实可以作为HCC的预测性生物标记物。

高甲胎蛋白（AFP）水平被认为是肝癌患者临床预后不良的一个预后标志物。最近，据报道，治疗后血清AFP水平下降与晚期HCC更好的ICI治疗效果有关。然而，checkmate040临床试验的结果表明，尽管基线AFP<400µg/L比AFP≥400µg/L与更长的OS相关，但无论基线AFP水平如何，ORR和DCR相似。鉴于AFP水平与患者的基线特征密切相关，应谨慎解释其预测效果。

外周血中的生物标记物具有低侵入性的巨大优势，同时大量研究也显示了其作为免疫治疗效果预测因子的潜力。然而，仍然缺乏来自大样本临床试验的支持性数据。此外，目前还没有证据表明，对于任何给定的生物标记物，血液样本的预测准确性优于组织样本。

越来越多的证据表明，肠道微生物群在先天性和适应性免疫的发展和调节中起着至关重要的作用，研究发现，肠道微生物群与ICI治疗反应之间似乎存在一定的关系。

Zheng等人最近通过宏基因组测序报告了肝癌抗PD-1免疫治疗期间肠道微生物组组成的动态变化。他们观察到，与无应答者相比，免疫治疗应答者的粪便样本显示出更高的分类丰富度和更多的基因计数，反应组的微生物组成保持相对稳定，而无反应组的变形菌数量从第3周开始显著增加，并在第12周占优势。此外，据报道，ICI治疗开始时使用抗生素与更差的结果相关，表明肠道微生物群对HCC治疗的影响。目前正在进行一项临床试验（NCT03785210），以评估联合抗生素（万古霉素）和ICI疗法的疗效。

参考文献

1. Pallozzi M, et al. Non-Invasive Biomarkers for Immunotherapy in Patients with Hepatocellular Carcinoma: Current Knowledge and Future Perspectives. Cancers (Basel). 2022 Sep 23;14(19):4631. doi: 10.3390/cancers14194631. PMID: 36230554; PMCID: PMC9559710.

2. Biomarkers and Future Perspectives forHepatocellular Carcinoma Immunotherapy. Front Oncol. 2021; 11: 716844.