“无用之用”，探索lncRNA的隐秘世界
例如我们的阑尾，是一个由于人类饮食结构变化而在演化过程中逐渐退化的器官，甚至得了阑尾炎还很痛，那人类基因组中98.5%的非编码序列，也是如此吗？近年来，对于lncRNA（即长度大于200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA）的生物学功能研究已成为国内外学者的研究热点，并且有越来越多的研究表明，lncRNA在基因表达调控过程中具有的重要地位。lncRNA的合成主要通过RNA聚合酶II（Pol II）进行转录，其5'端与7-甲基鸟苷（m7G）结合，在3'端则发生多聚腺苷酸化，同时也经历与mRNA相似的剪接过程。
一、lncRNA的功能
lncRNA可以与DNA、RNA、蛋白质等多种分子相互作用，调控染色体结构和功能；或者顺式或反式调节基因的转录，影响mRNA的剪接、稳定和翻译等，如下图所示：
图1 细胞内lncRNA的作用
已知的几种lncRNA的作用机制：1、对于某些lncRNA，上游启动子（橙色）转录方向是双向的，其中一个方向相对容易被降解。2、通过抑制RNA聚合酶II的募集或诱导染色质重塑，对下游基因表达（蓝色）产生影响。3、反向转录（紫色）与正向转录（蓝色）结合，阻断剪接体对剪接位点的识别，形成选择性剪接转录。4、反向转录（紫色）与正向转录（蓝色）结合，通过Dicer产生内源性siRNA。5、结合特定的蛋白质伴侣，非编码转录（绿色）调节蛋白质的活性。6、作为结构成分，有助于形成更大的RNA蛋白质复合物。7、影响蛋白质在细胞中的定位。8、经过加工作用，生成各类小RNA。
二、lncRNA的研究思路
lncRNA的研究大致可以分为几个步骤，如下图所示：
图2 lncRNA一般研究策略
1、目标lncRNA筛选
A、通过访问公共数据库，例如Ensemble、NCBI、LNCipedia等，可以筛选并获取已知的lncRNA信息，包括其基因序列、表达谱和功能注释等。
B、利用公共数据库中的高通量测序数据，例如RNA-Seq数据，可以鉴定不同组织或疾病状态下的差异表达基因，从中筛选出显著差异表达的lncRNA作为潜在目标。
C、查阅已发表的文献，特别是与研究领域相关的一些研究，寻找已经报道的lncRNA。
2、确定差异lncRNA特征
A、通过使用5'和3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术，利用3′RACE获得3′端序列（基因特异性引物→3′末端），利用5′RACE获得5′端序列（基因特异性引物→5′末端），进而推断lncRNA的全长序列。此外，使用全长cDNA克隆和测序也是一种获得lncRNA全长序列的方法。
B、可以使用RNA-FISH原位杂交技术对目标lncRNA的亚细胞定位进行准确定位。另外，可以使用细胞核/质分离试剂盒来分离细胞核和细胞质，并从分离后的细胞组分中提取RNA。随后，利用qRT-PCR技术对目标lncRNA进行检测，以确定其在细胞核和细胞质中的分布。
C、利用qRT-PCR检测lncRNA在不同细胞或者组织中的表达水平。
3、lncRNA功能研究中常用的调控手段
通过多种实验手段和技术方法，进行lncRNA功能性研究，包括RNA干扰、基因敲除、过表达等实验，从而验证目标lncRNA在特定细胞过程或疾病中的功能。
A、RNA干扰（RNA interference）: 使用小干扰RNA (siRNA) 来沉默lncRNA的表达，其原理是细胞质定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元复合物以RISC的形式被Dicer酶降解。对于细胞核中的lncRNA来说，ASO（15～25个核苷酸的化学修饰短链核酸）可与之形成DNA-RNA复合物被RNase H分解（可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA）。
B、过表达（Overexpression）: 将lncRNA基因过表达到相对较高的水平，可通过观察细胞表型的变化，可以进一步验证和探究lncRNA的功能。
C、基因敲除（Gene knockout）: 利用CRISPR/Cas9技术直接敲除lncRNA基因，进一步研究lncRNA在细胞/体内的功能。通过比较敲除细胞/动物和野生型细胞/动物之间的表型差异，可以深入了解lncRNA在生理、发育和疾病过程中发挥的重要调节作用。
4、lncRNA机制研究
为了进一步研究和解析目标lncRNA的作用机制，可以使用多种技术，如ChIRP、RIP、ChIP-seq、双荧光素酶、RNA pull-down等。接下来，我们将介绍其中一些技术。
A、lncRNA与DNA的相互作用
使用CHIRP（Chromatin isolation by RNA purifications）技术，可以在活细胞状态下形成lncRNA-染色质复合物，并通过超声打断染色质。然后，使用生物素标记的探针与lncRNA分子杂交，利用亲和素磁珠纯化lncRNA及其结合的染色质片段。最后，通过WB、质谱等方法进行结果分析，如图3所示[2]。
图3 ChIRP实验原理
B、lncRNA与miRNA的相互作用
通过荧光素酶实验，可以构建lncRNA基因报告基因载体，并与miRNA mimics共转染至293T工具细胞中，以验证lncRNA与miRNA之间的相互作用。通过监测荧光素酶活性的变化来间接评估lncRNA与miRNA之间的结合程度及其调节效应。
C、lncRNA与蛋白质的相互作用
可以使用RNA-Pull down技术进行检测。通过生物素特异标记的lncRNA探针与细胞质蛋白提取液进行联合孵育，形成lncRNA-蛋白质复合物。该复合物可以与链亲和素标记的磁珠结合，从而实现分离效果。随后，对复合物进行洗脱纯化，并通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与lncRNA相互作用，如图4所示[3]。
图4 RNA-pull down实验原理
参考文献：
1、Wilusz, Jeremy E et al. “Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world.” Genes & development vol. 23,13 (2009): 1494-504. doi:10.1101/gad.1800909
2、Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.” Cell vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025
3、Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.” Cell vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025
