核糖凝胶电泳技术-2（影响因素、可视化）

琼脂糖凝胶和 DNA 构象

DNA 片段的构象也决定了它在凝胶中迁移的能力。

让我们用质粒的例子来说明这个概念。

未切割的质粒至少存在三种构象：超螺旋、线性和开放环状。在三种质粒构象中，超螺旋 DNA 是最紧凑的形式，最容易迁移，因此通过琼脂糖凝胶最远。其次是线性形式，然后是开放的圆形构象，它在这三种未切割质粒 DNA 构象中迁移的距离最短。

每当未切割的质粒在琼脂糖凝胶上运行时，都会看到三个条带按此迁移顺序（最短行进距离到最远行进距离）：开放圆形 < 线性 < 超螺旋。

但是为什么会这样呢？

让我们试着用一个羊毛球来类比质粒来回答这个问题。

考虑一个纱线球，它以三种不同的构象存在，如下图所示。

如图 1 所示，该纱线需要穿过一个开口。纱线最左侧的构象对应于质粒的大开口环状形式，中间的对应于线性形式，最右边的对应于超螺旋形式 .

请注意，每种构造中的羊毛片长度相同。

图 1. 构象影响迁移的原因说明。

尽管长度相同，但纱线的迁移取决于其构造。 这解释了为什么不同构象的相同质粒在琼脂糖凝胶中具有不同的迁移距离。

当使用限制性核酸内切酶 (RE) 消化将同一质粒线性化时，这种形式尽管与环状（非线性）质粒具有相同的分子量，但在通过琼脂糖凝胶时会给出一条带，因为超螺旋和开放环状 构象缺失。这是区分和分离线性化（通过单位点 RE 消化）分子与同一质粒未消化分子的简单方法。

如何可视化凝胶中的 DNA 分子

DNA 分子太小，人眼无法看到。 即使在普通显微镜下，也看不到它。

那么，科学家如何观察琼脂糖凝胶中的 DNA 分子，从而得出有关 DNA 大小、构象等的必要推论呢？

研究人员将一种称为溴化乙锭的化合物与琼脂糖凝胶混合，以在凝胶中观察 DNA。

溴化乙锭 (EtBr) 在紫外 (UV) 光下发出荧光并嵌入 DNA 的大沟中，如下图 2所示。

EtBr 的这两个特性已被用于琼脂糖凝胶中 DNA 的染色和可视化。EtBr 被认为是致癌物质，现在流行更安全的替代染色方法。 GelRed 产品是值得考虑的替代品。

图 2.a) 表示 EtBr 如何插入 DNA。 b) DNA 条带如何在紫外线下发出荧光并显示出来。