ATR介导的FANCI磷酸化同时调控FANCD2的泛素化和去泛素化

写在前面

        今天推荐的是由澳大利亚圣文森特医学研究所团队在2020年2月4日发表于Front Cell Dev Biol（IF：5.196，JCR 2区）的一篇文章，通讯作者是Andrew J. Deans教授，研究表明ATR激酶促进FANCD2在DNA修复中以泛素化的形式积聚，从而维持FA途径的激活。

研究背景

        DNA链间交联（ICLs）是复制的物理屏障，对细胞活力有毒性。ICLs阻止DNA链分离，从而抑制DNA转录和复制相关复合物的正常功能。许多化疗药物通过诱导ICLs杀死癌细胞。修复ICLs的关键步骤是通过单泛素化对FA途径中的FANCD2蛋白进行生化修饰。该途径的遗传缺陷导致Fanconi贫血（FA），其特征是对DNA交联剂敏感、骨髓衰竭、不孕不育和癌症易感性。

        FA途径是去除ICLs进行DNA修复的一个重要机制，该途径由FANCD2及其伴侣蛋白FANCI的单泛素化启动。FANCD2的单泛素化在时间和空间上受FA核心复合物（E3环连接酶）、USP1:UAF1（去泛素化酶）和ATR激酶的调控。FANCI是FANCD2的异源二聚体，在这一调控中起着重要作用。特别是，FANCI本身是FA核心复合物的单泛素化靶点，又是ATR激酶的底物，并含有FANCD2去泛素化所必需的USP1:UAF1的结合位点。在ICL修复过程中，FANCD2作为异源二聚体与FANCI结合，向含有泛素结合域的DNA修复蛋白发出信号，并通过同源重组或转译合成促进DNA修复。

摘要部分

        作者的研究证明了FANCD2和FANCI单泛素化形式的维持是由ATR激酶调控的。在生化重组实验中，作者发现ATR直接在556、559和565位的丝氨酸（S）上磷酸化FANCI，从而稳定FANCI与DNA和FANCD2的结合。这种与DNA结合的增强会刺激泛素与FANCI和FANCD2结合，也抑制了它们的去泛素化。利用FANCI模拟磷酸化和去磷酸化的突变体，作者发现S559和S565对于保护复合物免受去泛素化酶USP1:UAF1的影响特别重要。作者的研究结果表明，ATR激酶可以促进泛素化形式的FANCD2在DNA修复中积聚，这是ATR激酶维持FA通路激活的一个主要机制。

研究内容

1.重组FANCI:FANCD2复合物的去磷酸化抑制其在体外的单泛化     

        作者从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化获得一定比例的重组FANCI，结果发现其在S/TQ簇结构域内被磷酸化。串联质谱（MS/MS）分析也表明，FANCI在多个丝氨酸残基位点都有磷酸化，包括先前报道的S557、S560和S566，它们对应于在进化中保守的表面暴露残基。但是，结合了FANCD2的FANCI与未结合的FANCI的结构并不相同。作者预测ATR是在S557、S560和S566位点磷酸化FANCI的激酶。     

        为探究已确定的磷酸化位点对FANCD2:FANCI单泛素化的作用，作者进行了磷酸酶处理，然后通过重组FA核心复合物进行体外泛素化。结果发现，在人和非洲爪蟾的FANCI:FANCD2中，λ-磷酸酶的处理几乎完全消除了FANCI的单泛素化，并显著降低了FANCD2的单泛素化速率。作者还发现，在这些制剂中再加入重组ATR-ATRIP激酶可以恢复它们的单泛素化水平。结合特异性磷酸抗体和质谱的分析，作者证明了FANCI的三个丝氨酸残基是ATR激酶的底物，也是FANCI:FANCD2单泛素化所必需的。

        游离的hFANCI，以及一定程度的hFANCD2也可作为FA核心复合物单泛素化的底物。作者发现hFANCI在游离状态下更快地被单泛素化，而游离FANCD2则保持非泛素化状态。此外，游离FANCI的泛素化速度与ATR-ATRIP处理的FANCI一样快，但在去磷酸化时它们的泛素化非常缓慢。

研究结论：FANCI和FANCD2的单泛素化需要FANCI的磷酸化。不管FANCI是否与FANCD2结合，FANCI的磷酸化都会特异性地介导其对FANCI的影响。

2.FANCI的S6D拟磷酸突变体与FANCD2结合的亲和力降低

        除了上述残基外，还有三个S/TQ残基被预测为FANCI中保守的ATR位点。已知S597、S618和S630残基完全被埋藏在FANCI的螺线管结构中，如果蛋白结构没有完全展开，任何激酶不可能接近。尽管如此，xFANCI-S6D（6个S突变为D的“模拟磷酸化”）和xFANCI-S6A（6个S突变为A的“无磷酸化”）突变体随后被用于假定FANCI的磷酸化导致FANCD2和FANCI解离。然而，作者的体外研究显示，ATR介导的FANCI磷酸化并没有导致FANCD2:FANCI异源二聚体解离。然后作者对xFANCI-S6D进行了测试，并确认它与xFANCD2的结合减少。通过生物层析测定法，作者发现这是由于xFANCI-S6D与xFANCD2的亲和力相对于WT下降了一个数量级，而xFANCI-S6A与xFANCD2的结合正常，其亲和力与WT相似。

        在重组ATR-ATRIP磷酸化FANCI蛋白的质谱研究中，作者从未观察到S597、S618和S630的磷酸化，最近的一篇文章也未能在内源性人FANCI中发现这些位点的磷酸化。因此，作者认为S557/S560/S566（3SQ簇）可能是FANCI中的ATR磷酸化功能盒。研究发现，与xFANCI-S6D不同，每个xFANCI-3SQ突变体都以1:1的比例与xFANCD2结合。

 研究结论：ATR激酶对FANCI蛋白表面3SQ簇的调控不会导致异二聚体的解离，并且可能在FANCD2和/或FANCI单泛素化的调节中起着其他作用。

3.FANCI在3SQ簇的磷酸化通过增加FANCI:D2在DNA上的滞留而促进其单泛素化

        为探究xFANCI在3SQ簇的磷酸化是否影响FANCI:FANCD2的泛素化，作者进行了体外泛素化检测。实验发现，与WT相比，四个xFANCI的拟磷酸突变体（ADD、ADA、DAD和DDD）的xFANCI:FANCD2复合体有更高的单泛素化速率。其中，FANCI-ADD和-DDD突变体的单泛素化速率最高。与之相反，FANCI-3SQ（AAD和AAA）以及FANCI-6SQ（S6D和S6A）的突变体使得xFANCD2的单泛素化速率比WT更低。

        先前的研究表明，最佳的FANCI:FANCD2单泛素化需要该复合物与DNA的结合。因此作者推测，磷酸化可能会增加FANCI:FANCD2对DNA的亲和力。EMSAs的实验显示，与对照组相比，λ-磷酸酶处理的FANCI:FANCD2复合物或FANCI-AAA突变体与DNA的结合力大大降低。作者进一步测试了游离的FANCI与DNA的结合，结果发现磷酸酶处理也导致其与DNA的结合减少，而ATR激酶的处理可以恢复这种结合。

研究结论：ATR介导的磷酸化作用使得FANCI（和相关的FANCD2）对DNA的结合具有更高的亲和力，从而刺激FA核心复合物对FANCD2的单泛素化。

4.FANCI的磷酸化或拟磷酸化也能保护FANCD2免于去泛素化

        已发表的证据表明，ATR对FANCI的磷酸化也能调控FANCD2的去泛素化。为了探究USP1:UAF1对FANCI的去泛素化活性是否受3SQ簇的调控，作者在体外进行去泛素化反应。作者在xFANCIub:xFANCD2Ub泛素化后加入λ-磷酸酶处理，结果发现大部分的xFANCIub在天然状态下对去泛素化具有抗性，但去磷酸化加速了它的去泛素化反应。此外，xFANCD2Ub的去泛素化速率也明显更快，而xFANCIub:xFANCD2Ub复合物的再磷酸化可以减慢USP1:UAF1介导的去泛素化速率。总的来说，当与FANCI-ADD或WT-FANCI结合时，FANCD2的去泛素化速率比与FANCI-AAA结合时慢四倍。

研究结论：ATR介导的FANCI磷酸化既促进了FANCD2的单泛素化，又抑制了FANCD2的去泛素化。

结论与讨论

        作者的研究表明,ATR对FANCI的直接磷酸化影响了FANCD2的泛素化和去泛素化。因此,FANCI磷酸化的调控在稳定FANCD2的单泛素化中起着双重作用，这有利于我们进一步了解Fanconi贫血与癌症的相关机制。另外，鉴于FANCI作为ATR靶点的重要性， FANCI-3SQ簇的磷酸化状态可能是目前正在进行临床试验的几类ATR激酶抑制剂治疗癌症有效性的适当生物标志物。

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原文链接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00002/full