USP11通过PPP1CA介导的ERK/MAPK信号通路激活促进结直肠癌的生长和转移

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院在2019年8月23日发表于EBioMedicine（2020IF：8.143，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Zhihai Peng教授，研究表明USP11通过PPP1CA介导的ERK/MAPK信号通路激活促进结直肠癌的生长和转移。

研究背景

        USP11是一种泛素特异性蛋白酶，通过不同的机制在肿瘤进展中发挥重要作用。然而，USP11在结直肠癌（CRC）中的表达和预后意义仍然未知。

摘要部分

        USP11在结直肠癌组织中过度表达并起到致癌基因的作用。USP11的过表达或敲低分别促进或抑制了体外和体内CRC细胞的生长和转移。从机制上讲，USP11通过去泛素化和保护PPP1CA免受蛋白酶体介导的降解来稳定PPP1CA。此外，USP11/PPP1CA复合物通过激活ERK/MAPK信号通路促进CRC进展。

研究内容

1.USP11在CRC中过度表达并与不良预后相关     

        为了评估CRC和正常组织中USP11的表达水平，作者分析了Oncomine平台上的公共数据，作者发现CRC组织中USP11的mRNA水平高于正常组织。作者还使用 qPCR分析了CRC中USP11的mRNA水平。作者发现CRC组织与配对的相邻组织相比显示出更高的USP11水平。Western blot显示，与相邻的正常结肠粘膜相比，结直肠癌组织中的USP11蛋白水平也显着过表达。此外， IHC染色显示，与邻近结肠组织相比，结直肠癌中USP11的蛋白质表达水平更高。这些结果表明USP11在CRC组织中mRNA和蛋白质水平的表达增加。

        作者进一步分析了USP11蛋白表达与CRC临床病理特征之间的相关性，发现USP11高表达与肿瘤分期、肿瘤T分期和 M分期呈正相关。此外，应用Kaplan-Meier生存分析与log-rank检验来评估USP11预测CRC患者生存的预后价值，结果显示，与低水平的患者相比，USP11蛋白表达水平高的患者总生存率（OS）较低。

研究结论：USP11过表达可能与CRC的肿瘤发生和进展有关。

2.USP11在体外促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭

        为了探讨USP11基因在促进CRC发展中的潜在作用，作者测量了不同CRC细胞系中USP11的表达水平。HCT116和HCT8细胞分别在mRNA和蛋白质水平上显示出最高和最低的USP11表达水平。作者选择 HCT116和HCT8细胞系进行进一步实验，并用适当的对照构建USP11敲低和过表达细胞。Cell Counting Kit 8 (CCK8) 检测表明，与对照组相比，USP11敲低显着抑制HCT116细胞的细胞活力和增殖，而在USP11过表达的HCT8细胞中观察到相反的效果。使用集落形成分析进一步证实了这些发现。此外，伤口愈合试验表明，与对照相比，USP11敲低抑制了伤口闭合。相反，USP11过表达促进了HCT8细胞中的伤口闭合。Transwell迁移和侵袭测定还显示，与对照相比，USP11敲低或过表达分别导致更低或更高的细胞迁移和侵袭率。然而，流式细胞术凋亡分析显示USP11过表达和敲低均不影响CRC细胞系的凋亡率。

研究结论：体外试验表明USP11增强了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭，但对细胞凋亡没有影响。

3.USP11在体内增强CRC的肿瘤发生和肝转移

        作者构建一种皮下异种移植模型来评估体内癌细胞的肿瘤发生能力以及USP11对增殖和肿瘤发生的影响。转染 shUSP11质粒的HCT116细胞产生的肿瘤体积小于对照。源自USP11过表达HCT8细胞的平均肿瘤体积比对照生长得更快。IHC 染色显示，与对照相比，分别在USP11敲低或过表达的异种移植肿瘤中，Ki-67 蛋白表达减弱或增强。由于肝脏是CRC患者中最常见的转移器官，作者将CRC细胞注射到裸鼠的脾脏中，发现USP11敲低或过表达分别诱导肝脏中更少或更多的转移性结节。

研究结论：USP11通过增加体内CRC细胞增殖和肝转移来促进CRC的进展。

4.USP11与PPP1CA有相互作用

        为了探索USP11如何促进CRC的进展，作者首先用 Flag-USP11质粒或EV质粒转染 HEK293T细胞。然后，作者使用二维PAGE电泳和液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 来鉴定由USP11过表达引起的蛋白质表达改变，并对差异蛋白进行KOG分析，这些结果表明USP11可能在调节蛋白磷酸酶稳定中起作用。PPP1CA被证明通过MAPK途径参与肿瘤发生，作者假定USP11可能通过稳定PPP1CA来促进CRC的进展。为了验证该设想，作者研究了USP11和PPP1CA之间潜在的生化相互关系。作者发现USP11敲低降低了PPP1CA表达，而USP11过表达略微增加了PPP1CA表达。然后作者在HCT116细胞中进行了内源性Co-IP检测，结果显示USP11可以与HCT116细胞中的PPP1CA形成复合物。通过将Flag-USP11和 Myc-PPP1CA共转染到293T细胞中，进一步进行外源Co-IP检测，结果显示Myc-PPP1CA与 Flag-USP11发生免疫共沉淀。

研究结论：USP11和PPP1CA可以发生内源性和外源性的相互作用。

5.USP11稳定PPP1CA并保护其免受蛋白酶体降解

        蛋白质翻译后修饰，并通过去泛素化稳定下游目标。因此，作者研究了USP11是否可以通过去泛素化来稳定PPP1CA的表达。作者发现在HCT8或 HCT116细胞中转染过表达或敲低USP11分别增加或减少了PPP1CA表达。然而，PPP1CA的敲低或过表达不影响USP11蛋白水平。通过 qRT-PCR，USP11的敲低和过表达均未引起PPP1CA mRNA水平的显着变化。这些发现表明USP11在翻译后调节PPP1CA。泛素化和去泛素化维持蛋白质修饰的稳态，异常泛素化经常导致细胞生物功能的改变。然而，尚不清楚USP11是否可以通过去泛素化来稳定PPP1CA的表达。作者将Myc-PPP1CA和 HA-泛素质粒共转染到用Flag-USP11质粒或EV转染的293T细胞中。泛素化分析进一步揭示USP11过表达显着抑制了PPP1CA蛋白的多泛素化。相反，在HCT116细胞中通过shRNA敲低USP11增加了PPP1CA蛋白的多泛素化水平。为了证明USP11在翻译后水平而不是蛋白质合成水平上影响PPP1CA表达，使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮来研究PPP1CA的降解率。与对照相比，USP11的敲低或过表达分别导致添加CHX后PPP1CA的蛋白质稳定性更低或更高。这些结果表明PPP1CA蛋白的降解率分别由于USP11敲低或过表达而增加或减少。由于USP11主要在泛素化水平上修饰蛋白质表达，作者同时用CHX和蛋白酶体抑制剂 MG-132 (15 μM) 处理CRC细胞。作者发现由低USP11表达引起的PPP1CA降解被恢复。

研究结论：USP11可以通过去泛素化稳定PPP1CA并防止泛素介导的蛋白酶体降解。

6.USP11以PPP1CA依赖性方式促进MAPK信号通路

        为了研究在CRC进展过程中USP11是否调节 MAPK 通路激活，作者进一步检查了参与MAPK通路的关键蛋白的水平。蛋白质印迹分析表明，HCT116细胞中USP11的敲低降低了磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/ 2)，但不影响ERK1/2水平。相反，USP11在HCT8细胞中的过表达增加了p-ERK1/2蛋白水平。此外，体内IHC染色显示过表达或敲低USP11还可以增强或减少通过注射USP11过表达或敲低细胞产生的异种移植肿瘤中的p-ERK1/2染色。这些结果表明USP11可以特异性激活ERK依赖性MAKP信号通路。接下来，作者进一步探究了PPP1CA在体外USP11介导的ERK/MAPK通路激活中的作用。作者发现PPP1CA过表达可以部分回补shUSP11质粒转染引起的ERK1/2磷酸化降低。此外，对于位于ERK1/2上游的MEK1/2蛋白也观察到这些类似的结果。然而，p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白水平始终没有显着变化。

研究结论：USP11以依赖于PPP1CA的方式积极调节ERK/MAPK信号通路。

7.PPP1CA对USP11介导的CRC促进必不可少

        据报道，PPP1CA是蛋白磷酸酶 1 (PP1) 的三个催化亚基之一，已被证明与恶性肿瘤的发展密切相关。为了研究PPP1CA是否影响USP11在CRC中的致癌作用，作者使用 CCK-8和transwell测定来研究PPP1CA对USP11促进的CRC细胞系增殖和迁移的影响。作者发现PPP1CA的过表达可以通过敲低HCT116细胞中的USP11来部分恢复对细胞增殖和迁移的抑制作用。此外，这些由USP11或PPP1CA表达增加引起的对细胞增殖和迁移的促进作用可能会被ERK1/2抑制剂SCH772984减弱。为了进一步验证PPP1CA对USP11体内致癌作用的影响，作者将过表达PPP1CA的质粒转染到USP11敲低HCT116细胞中，并将这些细胞皮下注射到裸鼠中。皮下异种移植试验显示，与对照组相比，在用 shUSP11质粒转染的 HCT116细胞中过表达PPP1CA产生的肿瘤体积更大。相反，sh-PPP1CA降低了由USP11过表达引起的异种移植肿瘤生长。此外，体内转移测定还表明PPP1CA对于USP11介导的CRC转移促进是必不可少的。

研究结论：PPP1CA对USP11介导的CRC进展至关重要。

结论与讨论

        使用RNA-seq分析， 作者发现SDC2是ARID1A缺失后的下游目标。机制研究表明,ARID1A缺失通过染色质重塑转录激活SDC2，其中SWISNF复合物中的结构变化使SDC2的转录激活增强。作者发现SDC2激活致癌信号，如PI3K/Akt、Ras/MAPK和Wnt/LRP6信号通路， 以促进SCC的发生和进展。作者的研究结果表明,TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2轴对SCCs的进展至关重要这一发现为靶向TRIM32或SDC2治疗ARID1A表达水平低的SCc病例提供了一个潜在的策略。

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原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.08.061