单细胞测序样本处理指南（二）- 实验样本的获得

接上一期，今天小编整理一下实验样本的获得，我们按照临床组织样本、动物组织样本、临床血液样本、培养细胞样本等组织类型分别介绍具体获得细节及注意事项等。

一、临床组织样本获得

💠 选取临床组织的获取对象需综合考虑饮食、烟酒习惯、药物、生物钟时间规律等多种影响因素。建议实验组样本与对照组样本的采集状态尽量保持一致，以尽可能降低其它未知的因素对于单细胞测序实验结果的影响。

💠 建议所取组织块（如原位肿瘤、癌旁组织、转移灶等）尽可能有代表性，尽可能去除组织样本中非研究所需的其它组织，如组织大小推荐为绿豆粒大小（0.2-0.4cm3），湿重约为100-200mg，若组织量较为充裕，建议分割成多个备份样本，分别保存。

💠 如条件允许，推荐先用生理盐水或PBS迅速漂洗样本，以去除血渍和污物等可能影响后续实验结果的物质。

💠 为了维持临床组织样本中细胞的初始状态和活性，在取得新鲜洁净的临床组织样本块后，尽量保持置于冰上低温（0-4℃）保存，尽量在2h内进行后续的单细胞悬液制备实验。详细操作步骤参见后续章节（单细胞悬液制备方案）。

💠 如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞悬液制备实验，可选择将临床组织样本（湿重100-200mg，约绿豆粒大小），投入装有1mL预冷的组织冷藏保存液的离心管中，进行低温保存和运输。详细操作步骤参见后续章节（组织样本的冷藏保存和运输），建议在24-48小时内进行后续的单细胞悬液制备和单细胞测序实验。

二、动物组织样本获得

💠 选取动物组织的获取对象，需综合考虑实验动物的品系、周龄/月龄、性别、饲养条件、健康状况、实验表型等多种影响因素。建议实验组样本与对照组样本的采集状态尽量保持一致，以尽可能降低其它未知的因素对于单细胞测序实验结果的影响。

💠 建议所取组织块尽可能有代表性（如正常脏器、病患组织、移植瘤等），尽可能去除组织样本中非研究所需的其它组织，如组织大小推荐为绿豆粒大小（0.2-0.4cm3），湿重约为100-200mg，若组织量较为充裕，建议分割成多个备份样本，分别保存。

💠 如条件允许，推荐先用生理盐水或PBS迅速漂洗样本，以去除血渍和污物等可能影响后续实验结果的物质。

💠 为了维持动物组织样本中细胞的初始状态和活性，在取得新鲜洁净的动物组织样本块后，尽量保持置于冰上低温（0-4℃）保存，尽量在2h内进行后续的单细胞悬液制备实验。详细操作步骤参见后续章节（单细胞悬液制备方案）。

💠 如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞悬液制备实验，可选择将动物组织样本（湿重100-200mg，约绿豆粒大小），投入装有1mL预冷的组织冷藏保存液的离心管中，进行低温保存和运输。详细操作步骤参见后续章节（组织样本的冷藏保存和运输），建议在24-48小时内进行后续的单细胞悬液制备和单细胞测序实验。

三、临床血液样本获得

💠 一般选用淡紫色盖，4mL或6mL规格的EDTA-K2真空采血管进行采血。

💠 采血对象须在安静状态下取得血液样本，并综合考虑饮食、烟酒习惯、药物、生物钟时间规律等多种影响因素。建议实验组样本与对照组样本的采血状态尽量保持一致，以尽可能降低其它未知的因素对于单细胞测序实验结果的影响。

💠 采血操作有创伤性，应严格按照无菌技术操作，一人一针一管，防止样本交叉污染。

💠 采血后，应立即将采血管轻柔的上下充分颠倒混匀5-8次，以使抗凝剂起效。

💠 按上述要求取得的新鲜血液样本，推荐将采血管垂直放置，置于常温保存，并在2h内提取外周血单核细胞（PBMC）。详细操作步骤参见后续章节（单细胞悬液制备方案）。

💠 如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞测序实验，在提取到状态良好的PBMC细胞后，可选择将适量的PBMC细胞（约5×105个），重悬于1mL细胞冷冻保存液中，并转移入2mL外螺旋式细胞冻存管中，程序降温至-80℃，最终长期保存于液氮中。详细操作步骤参见后续章节（细胞样本的冷冻保存和运输），建议在4周内复苏细胞样本并进行后续的单细胞测序实验。

四、培养细胞样本获得

💠 贴壁细胞：选取培养状态良好的贴壁细胞，吸去细胞培养基，加入1mL PBS润洗两次，加入适量0.25%的Trypsin-EDTA酶解液，置于37°细胞CO2培养箱中静置消化1-2min。显微镜下观察到细胞边缘收缩、开始从培养皿解离。用手轻轻拍打培养皿侧边缘，使解离的细胞呈“流沙状”滑落，立即加入至少5倍体积的完全培养基中止消化。随后将细胞悬液轻柔吹打混匀，转入15mL离心管中，室温离心300×g，5min。吸去上清，用10mL PBS重悬清洗细胞，共重复清洗两次即可。

💠 悬浮细胞：选取培养状态良好的悬浮细胞，直接将细胞悬液轻柔吹打混匀，一起转入15mL离心管中，室温离心300×g，5min。吸去上清，用10mL PBS重悬清洗细胞，共重复清洗两次即可。

💠 为了维持培养细胞的初始状态和活性，在取得状态良好的培养细胞后，应保持将样本置于冰上低温（0-4℃）保存，尽量在2h内进行后续的单细胞悬液制备实验。

💠 如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞测序实验，可选择将适量的培养细胞（约5×105个），重悬于1mL细胞冷冻保存液中，并转移入2mL外螺旋式细胞冻存管中，程序降温至-80℃，最终长期保存于液氮中。详细操作步骤参见后续章节（细胞样本的冷冻保存和运输），建议在4周内复苏细胞样本并进行后续的单细胞测序实验。