「2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛」蛋白质组学在表征新型蛋白质降解方面的

PROTAC（proteolysis-targeting chimeras）是一种异双功能分子，分子的一端连接结合靶蛋白的配体，一端连接E3连接酶的配体，中间通过合适的Linker相连。PROTAC降解靶蛋白是通过泛素蛋白酶体系统（UPS）实现的，其大致过程如下，PROTAC分子结合靶蛋白（POI）和E3连接酶，形成三元复合物，给靶蛋白打上泛素化的标签，泛素化的蛋白被细胞内的蛋白酶体26S识别并降解。

PROTAC技术是一种利用泛素－蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）对靶蛋白进行降解的药物开发技术。该技术可用来清除肿瘤细胞内的特定蛋白，使其不能发挥致癌作用，以达到肿瘤治疗的目的。肿瘤治疗后期的持续用药会由于肿瘤基因突变导致耐药性的发生，理论上PROTAC可以避免这样情况的发生。接下来这篇综述强调了“蛋白质组学”在更好地表征蛋白质降解的选择性、蛋白丰度和动态活性方面的重要作用。

基于质谱的蛋白质组学分析在药物发现中发挥了关键作用，判断PROTAC分子理论降解靶点和实际靶点是否一致，是否产生脱靶蛋白，是衡量该分子能否成药的关键。对于靶蛋白的选择是PROTAC需要了解的最重要参数之一，因脱离结合和降解的靶点（即脱靶）可以为未知的安全指标提供信息。蛋白质组学可以通过评估E3连接酶和目标蛋白的浓度并测量目标参与的实际数量来进一步区分表型中哪些方面是由结合驱动的，哪些是由降解驱动的。通过组学分析可以区分由降解和结合效应的不同而受到影响的途径，例如CDK9抑制剂与降解剂处理之间的基因转录差异。在这些情况下，通路方面的影响可以通过组学数据得到，并且转录与蛋白组学数据可以相辅相成。

细胞中目标蛋白质被降解的速度和可实现的最大降解水平受其数量与其自然补充的速度影响。一个自然快速补充的高丰度蛋白比一个没有补充的蛋白更难在一定时间内降解到显著水平。除了目标蛋白浓度外，E3连接酶的浓度是另一个重要的参数，基本上可以决定基于PROTAC的方法成功或失败。E3连接酶丰度影响的一个典型的例子是BCL-XL：Von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（VHL）的缺失阻止了基于VHL的BCL-XL PROTAC对血小板中BCL-XL的降解，从而限制了毒性并防止血小板减少症的发生。基于质谱的蛋白质组学分析是了解和预测蛋白质降解的的重要发现工具。为了确定这些蛋白质在感兴趣的组织中的丰度，可以使用依赖数据（DDA）和不依赖数据（DIA）的采集方法。相对表达量可以通过使用标记定量与非标定量组学技术以比较不同的细胞系和组织，并可与mRNA表达相结合确定在模型中差异表达的新E3连接酶。此外，DDA和DIA方法还可用于确定所关注的特定蛋白质的数量，这对于比较不同物种之间的E3水平尤其重要。

给定PROTAC疗效的另一个关键变量是被降解的蛋白质的周转率（PTR）。由于蛋白质的重新合成将是目标降解后功能恢复的一个因素，因此在开发早期测量蛋白质的半衰期可以帮助项目进展。在选择目标时尽早测量蛋白质周转率是至关重要的，因为周转率可以用来制定目标化合物的概况，并确定降解剂是否是最佳的药物模式。蛋白质的再合成可以在PROTAC处理和洗脱后使用传统的蛋白质水平定量方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测量，然而，实验测得的再合成率可以根据各种化合物的特性而变化，如最大降解水平、脱落率、蛋白质结合与亲脂性；另一种测量PTR常用方法是用抑制剂（如环己酮）来抑制蛋白质的合成，鉴于这些抑制剂广泛的生物学影响，以及细胞对其有限的容忍时间，使用蛋白质合成抑制剂测量的PTR缺乏准确性。

测量蛋白质PTR的金标准是SILAC（细胞培养条件下稳定同位素标记技术）质谱法。采用含有轻、 重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞传若干代后，细胞内蛋白被同位素稳定标记，将蛋白质等量混合后进行分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量。这些测量可以通过跟踪标记的和未标记的蛋白质来测量降解率和合成率。可以使用富集或非富集方法测量单个蛋白质的蛋白质周转情况。或者，可以同时测量数千种蛋白质的周转率。Zecha等人将SILAC与TMT标记定量组学技术相结合，从单个细胞系中产生了6000多个PTR,研究表明，蛋白质的不同蛋白质形式可以具有不同的周转率，这在设计和解释靶向PTR实验时具有重要意义。SILAC定量技术的进步也使非分裂细胞的周转率测量更加准确。

表征蛋白质降解剂的一个关键方面是能够区分降解的直接靶标和随时间推移的途径效应。多重蛋白质组动力学分析（mPDP）方法巧妙地将动态SILAC与蛋白质组学相结合，以研究蛋白质稳态调节剂的机制。在该方法中，细胞在标记的SILAC培养基中生长，并且在复合处理时，将培养基一式两份切换到相反的SILAC标记。多重质谱分析可以将成熟（预先存在的）蛋白质的变化与新生蛋白质（在化合物处理和标记交换后合成的蛋白质）区分开来。例如，该方法通过检测成熟和新生蛋白中BR2、BRD3和BRD4的丰度降低，成功的将类似于JQ1的BET抑制剂与JQ1-PROTAC区分开来，有趣的是，该方法还将FYTTD1（一种TREX复合物衔接物）鉴定为JQ1的脱靶，导致蛋白质合成的下游停滞。由于SILAC标记的前处理要求，mPDP比标准的蛋白质组学实验更耗时，最适合用于复杂的机理问题研究。

最后作者对如何将蛋白质组学应用于PROTAC进行了总结（图1），包括用于测量选择性，蛋白质丰度和蛋白质动力学的测定。

总结

蛋白质组学能够在蛋白组水平上，深度分析不同样本之间蛋白的丰度差异，为PROTAC蛋白降解剂开发与优化提供必需的数据支持。

基于质谱的蛋白质组学分析是一种发现工具，使研究人员能够了解候选药物的作用机制。当应用PROTAC时，运用选择性降解蛋白以及与疗效和安全性相关机制的非依赖质谱采集技术相结合。蛋白组学的全局分析实验可以识别直接降解，并评估可能由降解或脱靶抑制引起的下游途径机制。靶向蛋白质组学方法可用于量化相关E3连接酶的水平以及目标细胞系和组织中的目标蛋白，并在项目早期提供有关的数据信息。此外，蛋白质组学方法可用于了解蛋白质周转和再合成率，并告知靶标可追踪性以及药代动力学/药效学理解。

会议信息

BPCF2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛四月与您相约北京！

主办单位：生物药资讯

会议主题：BPCF2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛

会议时间：2023年04月03-04号

会议地点：北京朗丽兹西山花园酒店