GST pull down 学习笔记

2023-07-02 14:56 作者:小杨今天瘦了没_ 0人读过 | 我要投稿

蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions, PPIs）在细胞生命活动中发挥关键作用，相互作用的蛋白可通过形成复杂的功能性复合体或参与细胞内一系列信号级联反应, 调控细胞及个体的生命活动。研究蛋白间相互作用的常用方法有酵母双杂、免疫共沉淀、GST pull down和双分子荧光互补等。其中，GST pull down作为体外检测蛋白间相互作用的有效方法，既可用于验证已知蛋白间的PPIs，也可用作未知PPIs的初始筛选测定法，还能用于寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

原理：

GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST（谷胱甘肽-S-转移酶）与固化在载体上的GSH（谷胱甘肽）亲和结合。简单来说，假定a蛋白和b蛋白可能存在相互作用，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的sepharose beads（琼脂糖凝珠）混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。通过WB检测结果，可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down（GST对照只显示一个条带）。

实验流程：

GST pull down 流程诱饵蛋白即原理中提到的protein a，作用蛋白即原理中提到的protein b

实验步骤：

1. 球珠蛋白体系的制备

1.1. 制备GST-a融合蛋白

（i）将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；

（ii）挑取单个克隆到含有LB培养基（+氨苄）的试管里，37℃培养过夜；

（iii）将培养菌液转移到含有LB培养基（+氨苄）的锥形瓶中，37℃摇床培养数小时；

（iv）测定OD600值，达到合适值后加入适当浓度IPTG，合适条件下继续培养（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；

（v）诱导适当时间后，将菌液分次倒入离心管中，4℃ 离心并弃去上清收集管底菌体，菌体置于-20℃条件，如暂时不用，可将菌体存于-80℃冰箱中；

（vi）室温冻融菌体，马上置于冰上，加入细菌裂解液并吹打混匀；

（vii）将混合菌体置于冰上超声破碎（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定）至溶液澄清；

（viii）离心取上清并转移至新的离心管中，-80℃保存备用。

1.2. 制备球珠蛋白体系并纯化

（i）在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积GSH-sepharose beads，4℃摇床上缓慢摇动;

（ii）离心弃去上清，GSH-sepharose beads上即结合GST-a融合蛋白；

（iii）加入预冷的PBS溶液，轻晃悬浮beads，将sepharose洗涤一次，4℃离心弃去上清，重复此步骤3次；

（iv）最后一次用移液枪吸走珠子表面液体（注意不要吸走珠子），即可获得结合GST-a的beads。

2. b蛋白的制备

2.1. 真核蛋白的提取：（i）收集细胞；（ii）细胞裂解与离心；（iii）蛋白提取。

2.2. 溶液预处理（选做）：将细胞裂解液与GSH- sepharose beads和GST在4℃下孵育。

这一步的目的是从裂解液中预先清除可非特异性地与GST片段相互作用或仅与beads相互作用的蛋白质。如果相互作用主要是通过针对候选相互作用蛋白的抗体来检测，则不需要用GST或GSH- sepharose beads预先清除裂解物。但当使用35S标记的细胞裂解物来鉴定新的蛋白质相互作用时，这些步骤可帮助减少背景。当检测与该蛋白抗体相互作用的蛋白时，需要包括“GST +beads”和“beads”对照。

3. 体系孵育与pull down

（i）将结合有GST-a融合蛋白的beads悬浮在适量体积的缓冲液中，加入细胞裂解液，同时采用结合有GST蛋白的beads和beads作阴性对照，在摇床上晃动（4℃）；

（ii）4℃离心弃去上清液，加入预冷缓冲液洗涤beads，重复此步骤3次；

（iii）吸干beads上液体后，加入蛋白电泳上样缓冲液沸水浴，放入-20℃冰箱备用。