一.文章基本信息

文章来源：郑艳玲, 姜八一, 张涌. DMEM与Ham's F-10培养基对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化影响比较研究[J]. 中国畜禽种业, 2022, 18(5): 26-29.
基金项目：转基因生物新品种培育科技重大专项（2008ZX080072004）；山东省农业良种工程项目（南种北繁），项目编号：2017LZN022。
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二.文章全文

摘 要： 本研究旨在比较DMEM 与Ham's F-10 两种培养基对牛骨骼肌卫星细胞体外培养过程中增殖与分化的影响。采用胶原酶和胰酶联用的方法分离骨骼肌卫星细胞后平均分为两组，分别采用DMEM 和Ham's F-10 培养基对两组细胞进行培养，采用RT-PCR 和免疫荧光方法对细胞进行鉴定，并观察比较两种培养基对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响。结论：本实验采用DMEM 培养基培养7d 后的牛骨骼肌卫星细胞不经过诱导分化能自行发生分化成肌管，而用Ham's F-10 培养基培养7d 后的牛骨骼肌卫星细胞90%以上处于增殖状态，仅有少量细胞发生分化融合成肌管。本研究结果表明，Ham's F-10 比DMEM 更有利于牛骨骼肌卫星细胞的增殖，抑制其分化。

关键词： 牛；骨骼肌卫星细胞；DMEM；Ham's F-10；增值；分化

骨骼肌卫星细胞(skeletal satellite cells) 是一类位于骨骼肌肌膜(sacrolenuna) 与基底膜(haaslelmin) 之间的成体干细胞 [1]，因其位置与排列类似肌细胞的卫星，因此被称为卫星细胞。1961 年，Muaor 首次从青蛙骨骼肌纤维中发现骨骼肌卫星细胞，这些细胞在骨骼肌生长发育和再生过程中发挥着非常重要作用 [2]。一般情况下，这些细胞处于静止状态，而当肌细胞受到损伤刺激时，骨骼肌卫星细胞即被激活、增殖并与原有的骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞 [3]，1974 年，Bischoff从大鼠骨骼肌中分离出骨骼肌卫星细胞，并对其进行了体外培养，随后很多种动物的骨骼肌卫星细胞被成功分离及培养 [4-10]。

体外培养骨骼肌卫星细胞可应用于组织工程、基因治疗及基因功能研究等多个方面，因此，有必要建立理想的骨骼肌卫星细胞的获取、培养与纯化的方法，为利用骨骼肌卫星细胞研究基因功能打下基础。以目前的实验方法所获得的骨骼肌卫星细胞中不可避免会混有成纤维细胞，因此，获得高纯度的骨骼肌卫星细胞一直是研究者不断追求的目标。本研究采用混合酶消化法分离得到了大量优质牛骨骼肌卫星细胞，采用DMEM和Ham’ s F-10 两种培养基对分离的骨骼肌卫星细胞进行培养比较研究，为获得高纯度牛骨骼肌卫星细胞，并使其处于增殖状态培养基的选择提供科学依据。

1 实验材料

牛胎儿取自西安屠宰场。置于4℃PBS 保存液中，在12 h内带回实验室。保存液为PBS+200 IU/ml 青霉素+200 IU/ml链霉素。

2 实验方法

2.1 骨骼肌卫星细胞的分离和培养

从西安屠宰场取60d 左右的牛胎儿，取其后肢肌肉组织，用含青链霉素的PBS 溶液将肌肉块冲洗干净，在无菌条件下剔除血管、结缔组织，将肌肉组织剪成尽量小的组织块，将剪碎的组织放入5ml 离心管中，加入1 倍体积的混合酶消化液（dispase II 2.4U/ml，collagenase 1%，CaCl2 2.5mmol/L)，37℃消化45min，其每间隔15min 用吸管吹打5min，重复3 次，然后加入两倍体积含20% FBS 的培养液中中止消化，反复吹打后滤过200 目的筛网，收集滤液，500g/min 离心7min，弃上清液，分两组分别用含15%胎牛血清的Ham’ s F-10 及DMEM 生长培养基重悬细胞。

2.2 骨骼肌卫星细胞的纯化

将装有重悬骨骼肌卫星细胞的培养皿置入37℃、5%CO2培养箱中培养0.5h，进行第一次贴壁，记为P1。0.5h 后，吸取培养皿上清液置入新的培养皿中，混匀，进行第2 次贴壁，记为P2。24h 后取P2 上清液，1000r/min 离心5min，弃上清，细胞沉淀用生长培养基重悬，移入新的培养皿中，进行第3 次贴壁，记为P3。弃去P1、P2，将培养有P3 细胞的培养皿中的细胞每隔2d 更换新的生长培养基继续培养，相差显微镜下观察细胞的形态及增殖状况。

2.3 骨骼肌卫星细胞生长曲线的确定

用四甲基偶氮唑盐实验（MTT）比色法测定细胞生长曲线。

2.4 骨骼肌卫星细胞RT-PCR 扩增鉴定

采用Trizol 试剂(Invitrogen) 提取贴壁生长48h 的卫星细胞总RNA，按照PrimeScript® RT reagent Kit (Perfect Real Time) 说明书合成cDNA 第一链，以cDNA 为模板对牛生肌调节基因MyoD、Myf5、Myogenin、MRF4 及β-actin 基因进行RT-PCR 扩增。引物序列如表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.5 骨骼肌卫星细胞的免疫荧光鉴定

取原代分离后传至第2 代的细胞，在DMEM培养基及Ham's F-10 培养基中均培养24h 及7d 后，采用免疫荧光方法鉴定骨骼肌卫星细胞的肌源性标志中间丝蛋白desmin 的表达，同时用hochest 对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察实验结果。以本实验室保存的成纤维细胞作为阴性对照。

3 结果

3.1 牛骨骼肌卫星细胞的获得与细胞生长曲线的测定

3.1.1 牛骨骼肌卫星细胞形态学观察结果

经酶消化后获得的骨骼肌卫星细胞为球形，将其接种在铺有多聚赖氨酸的细胞培养皿中，进行差速贴壁纯化后获得的骨骼肌卫星细胞在接种24h 后细胞开始贴壁，培养2d 后细胞贴壁完全并开始增殖。贴壁后绝大多数细胞为纺锤形或梭形，细胞体积比成纤维细胞要小，但核质比比较大，有两极性，胞核折光性较强。少数细胞呈现多角形的形状，有细胞突起，肌细胞之间会相互联结成网状（如图1 所示）。随着培养时间的延长，逐渐呈现有规律性的平行方向排列生长状态。

图1 贴壁生长2d 骨骼肌卫星细胞(×200）

3.1.2 采用MTT 法测定骨骼肌卫星细胞增殖状态

实验结果显示，接种24h 后细胞开始增殖，2d 后增殖旺盛，3d 后细胞增殖速度达到高峰，4d 后细胞逐渐停止增殖，其中Ham's F-10 培养基培养的细胞比DMEM 培养基培养的细胞增殖活力要高一些，结果如图2。

图2 不同培养基培养的骨骼肌卫星细胞生长曲线

3.2 骨骼肌卫星细胞RT-PCR 扩增鉴定结果

分离的骨骼肌卫星细胞在DMEM 培养基中培养2d，细胞处于增殖旺盛期，因此，进行RT-PCR 实验时能扩增出增殖期骨骼肌卫星细胞的标记基因MyoD 和Myf5，而分化期标记基因myogenin 和MRF4 也有表达，但表达量很少，说明分离的细胞为骨骼肌卫星细胞，结果如图3。

图3 骨骼肌卫星细胞标记基因RT-PCR 扩增结果
M：50 bp DNA Ladder；1：MyoD；2：Myf5；3：myogenin；4：MRF4

3.3 免疫荧光检测结果

荧光显微镜下观察结果显示，对照组成纤维细胞desmin 免疫荧光检测不发光，为阴性，如图4A；骨骼肌卫星细胞desmin 免疫荧光检测发红色荧光，为阳性，如图4B；分离的细胞在Ham's F-10 培养基中培养3d 后，细胞仍然处于增殖状态，培养4d 后细胞增殖变慢，培养7d 后骨骼肌卫星细胞的纯度达99%以上，接近100%，少量骨骼肌卫星细胞分化融合为肌管，细胞desmin 免疫荧光检测均发红色荧光，基本没有成纤维细胞存在，如图4C，说明，Ham's F-10 培养基对成纤维细胞的增殖有抑制作用；分离的细胞在DMEM 培养基中培养3d后，细胞达到80%以上的汇合度，骨骼肌卫星细胞增殖速度减慢，细胞进入分化阶段，细胞相互靠拢、融合，培养7d 后细胞完全融合成较粗的肌管，desmin 免疫荧光检测发红色荧光，肌管之间混杂有很多不发红色荧光的成纤维细胞，如图4D。

图4 牛骨骼肌卫星细胞免疫荧光检测结果（×200，标尺代表50μm）
（A1，B1，C1，D1）为细胞在自然光下观察的结果
（A2，B2，C2，D2）为Hoechst333258 核染色结果
（A3，B3，C3，D3）为desmin 染色结果
（A4，B4，C4，D4）为细胞核染色和desmin 染色的复合图

4 讨论

20 世纪70 年代，Richler 等建立起了分离和体外培养原代卫星细胞的实验技术。分离方法主要有组织块法、酶消化分离法等，而酶消化分离法主要有胶原酶、胰蛋白酶、链酶蛋白酶、中性蛋白酶及2 或3 种酶并用法等。在这些酶消化法中，研究者多采用胶原酶和胰酶分步消化或混合酶联合消化的方法进行卫星细胞的分离。采用胶原酶和胰蛋白酶分步消化法需要酶消化时间比较长，一般需要50～70min。本实验也采用了胶原酶和胰蛋白酶组成的混合酶对牛胎儿骨骼肌卫星细胞进行消化分离，在消化过程中，胶原酶使肌束肌纤维相互分离，而分散酶使肌卫星细胞从肌纤维上分离下来，实验时用混合酶仅需45min 即可使肌纤维相互分离并将骨骼肌卫星细胞从肌纤维上消化下来，大大节省了实验操作时间，同时消化时间的缩短可减少酶消化对细胞造成的损伤。

为了确定消化下来的细胞是否为骨骼肌卫星细胞，需要对获得的细胞进行鉴定。结蛋白(desmin) 是较早表达的肌源性标志蛋白之一，它是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分，体外培养形态类似于卫星细胞的成纤维细胞不表达这种蛋白，因此，结蛋白是鉴定肌卫星细胞的标志蛋白之一 [11-12]。消化下来的骨骼肌卫星细胞中掺杂有大量的成纤维细胞，如何从中纯化骨骼肌卫星细胞是骨骼肌卫星细胞分离的热点。利用免疫磁珠分选技术、流式细胞分选技术和平面黏附分离法等技术可获得高纯度的骨骼肌卫星细胞，但由于很多部门都缺乏相应的实验设备，并且实验所需抗体等试剂价格非常昂贵，使这种方法的广泛应用受限 [13]。在大多数实验室，人们通常采用差速贴壁的方法纯化骨骼肌卫星细胞，但这种方法也无法获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。人们在培养骨骼肌卫星细胞时所用的培养基主要是DMEM 培养基，在这种培养基中，随着培养时间的延长往往形成成纤维细胞的生长优势。而Thomas A.Rando 等对小鼠骨骼肌细胞进行分离时采用Ham's F-10 培养基对骨骼肌卫星细胞进行培养，发现在Ham's F-10 培养基中骨骼肌卫星细胞比成纤维细胞优先生长，随着培养时间的延长，骨骼肌卫星细胞不断得到富集。L.Zhang 等利用Ham's F-10 培养基对绵羊骨骼肌成肌细胞进行培养，得出随着培养时间的延长，Ham's F-10 培养基也能使绵羊骨骼肌成肌细胞富集的结论 [14]。本实验利用混合酶对胎牛骨骼肌进行消化，用DMEM 及Ham's F-10 分别对消化下来的混有成纤维细胞的骨骼肌卫星细胞进行纯化，然后用DMEM 及Ham's F-10 对纯化的骨骼肌卫星细胞进行培养，比较了两种培养基对骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，结果显示，用DMEM 培养基培养骨骼肌卫星细胞时，培养2d 肌细胞会相互融合，7d 后完全融合形成较粗的肌管，而利用Ham's F-10 培养基对骨骼肌成肌细胞进行培养时，骨骼肌卫星细胞90%以上的细胞处于增殖状态，只有很少数处于分化状态，并相互融合形成较细的肌管，同时，Ham's F-10 培养基能抑制成纤维细胞的增殖，因此，随着培养时间的延长，骨骼肌卫星细胞得到纯化，这样非常有利于在基因工程实验中对在骨骼肌卫星细胞进行转基因表达研究。Ham's F-10 培养基对成纤维细胞增殖的抑制作用机理及对骨骼肌卫星细胞分化融合的抑制作用机理还有待于进一步研究。

5 结论

本实验利用混合酶消化法及差速贴壁法分离培养得到高纯度牛骨骼肌卫星细胞。分离得到的骨骼肌卫星细胞在含15%胎牛血清的DMEM培养基中不需要分化培养基诱导，骨骼肌卫星细胞就可进行分化融合成肌管；在含15%胎牛血清的Ham's F-10 培养基中，骨骼肌卫星细胞90%以上的可不断进行增殖而不发生分化融合，同时，Ham's F-10 培养基可抑制成纤维细胞的增殖，因此，随着培养时间的延长，用Ham's F-10 培养基可进一步对骨骼肌卫星细胞进行纯化。

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来源：“中国畜禽种业”公众号,作者~。
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