Nat Commun│GmRR11调控大豆结瘤共生的分子机制

豆科植物成功的关键是能够形成和保持最佳的根瘤共生的能力，使根瘤菌生长和植物生长之间维持动态平衡的关系。细胞分裂素（CK）在结瘤的稳态调节中至关重要，但其作用机制仍不完全清楚。

2022年12月，华中农业大学李霞团队在Nature Communications上发表题为“The B-type response regulator GmRR11d mediates systemic inhibition of symbiotic nodulation”的研究论文，发现B型反应调节因子GmRR11d通过诱导大豆根系对CK的超敏反应，以及抑制结瘤信号关键基因的转录，控制大豆根瘤数量，调控大豆共生固氮反应。

研究结果

1.发现GmRR11d可以通过与GmNSP1互作参与结瘤生长调控过程

大豆中，NSP1（结瘤信号通路蛋白）可以激活（结瘤形成起始）基因转录，诱导根瘤发生，且受细胞分裂素介导，其在进化上具有保守性。基于此，研究者提出假设：大豆的结瘤自调控系统（AON），是否可以诱导某种转录因子抑制NSP1的转录活性，从而对结瘤形成负向调控，维持根瘤共生的动态平衡呢？为了验证此假设，研究者首先通过基因敲除等实验，进一步验证了GmNSP1对大豆结瘤形成的正向调控作用。接着，以GmNSP1a为诱饵通过酵母双杂交筛选技术，在大豆根瘤cDNA文库中筛选其互作蛋白。其中一种互作蛋白为B型RR蛋白，在拟南芥中的同源蛋白为ARR11，对细胞分裂素诱导的根生长具有重要调控作用。通过基因组搜索和结构域分析，发现大豆中存在4种ARR11同源基因，研究者分别将其命名为GmRR11a，GmRR11b，GmRR11c，GmRR11d，通过Y2H、Co-IP等进一步验证发现GmNSP1a与GmRR11d确实存在相互作用（图1），推测GmRR11d可以通过与GmNSP1a互作参与大豆结瘤生长调控过程。

图1 | GmRR11d与GmNSP1a存在相互作用

2.GmRR11d正向调控根对细胞分裂素的敏感性

研究者基于GmRR11d在拟南芥中的同源基因的功能，探索GmRR11d是否也介导大豆根生长发育对细胞分裂素的响应；通过在毛状根表达和两种载体，分别检测大豆根系的生长发育对不同浓度BAP（外源细胞分裂素）的响应，结果发现过表达的转基因大豆根系对细胞分裂素敏感性增强，根系生长受CKs的抑制性表现更敏感，而转基因大豆根系生长受CKs的抑制性减弱，对细胞分裂素敏感性显著降低（图2），说明GmRR11d是大豆中CK信号和植物CK响应的正调控因子。

图2 | GmRR11d响应细胞分裂素，正向调控大豆根系对CKs的敏感性

3.GmRR11d被根瘤菌诱导表达，并在根瘤中具有高表达量

通过qRT-PCR检测发现，在大豆根系中被根瘤菌快速诱导，在根瘤的形成过程中，表达量呈现为升-降-升-降的趋势；通过GUS组织染色检测发现，由根瘤菌诱导，并在整个根瘤形成过程中表达，且主要集中在根瘤的皮质区（图3）。

图3 | 大豆根瘤形成过程中的表达模式

4.GmRR11d在大豆结瘤过程中起着负调控因子的作用

通过功能验证实验，进一步明确GmRR11d在大豆结瘤过程中作用，研究者构建了和两种转基因大豆植株，并统计21DAI时根瘤数量，出乎意料的是，根产生的根瘤明显比对照根减少约41%，而敲除株，根瘤数量显著增加，几乎增加了一倍（图4），说明GmRR11d是大豆结瘤的关键负调控因子。

图4 | GmRR11d对大豆根瘤数量的影响

5.GmRR11d负调控根瘤数量的作用机制研究

进一步研究发现，GmRR11d主要通过两种方式对根瘤形成起负调控作用：一种是GmRR11d直接靶向启动子，行使负调控转录因子功能，抑制的转录表达（图5）；一种是GmRR11d通过与GmNSP1a互作，干扰GmNSP1a作为正向转录因子对的转录激活，从而抑制及其下游结瘤基因的表达（图6）。

此外，GmRR11d在大豆的结瘤自动调节系统(AON)中处于什么位置，扮演什么角色呢？研究者根据已得结果：被根瘤菌诱导，在根瘤形成开始时达到最高表达水平，但随着结瘤形成时间延长，负调控根瘤数量，提出假设可能被AON上调表达，从而抑制结瘤的进一步形成。为了验证该假设，研究者检测了野生型大豆、大豆（GmNARK敲除突变体，GmNARK是一种CLV1样受体激酶，可抑制芽中的结瘤数量）中转录水平，发现在受感染的根中转录几乎被完全阻断（图7a,b）。并且在两种植株中分别过表达，观察结瘤形成数量差异，发现nts1007突变体确实表现出超结瘤表型，而过表达的根瘤数量显著减少，突变体的超结瘤表型几乎完全得到恢复，说明GmNARK可能通过诱导根中的表达来抑制结瘤（图7efg）。另外，研究者发现GmRR11d作用机制与AON系统中已知的负调控因子GmTNL1b间不存在上下游调控关系。

已有研究表明，在拟南芥中，B型RR基因的转录水平对CKs不敏感，但CKs可以通过增强B型RR蛋白与靶基因的结合，调控根的生长发育。本研究中已证明了GmRR11d与拟南芥B型RR基因不同，它是受不同浓度的CKs诱导的，但是CKs是否也能增强GmRR11d与靶基因的结合呢？通过ChIP检测等进一步发现，细胞分裂素促进GmRR11d与启动子的结合，从而抑制的转录，参与根瘤形成的调控（图7h）。

图5 | GmRR11d直接靶向的启动子，抑制的表达

图6 | GmRR11d与GmNSP1a相互作用并抑制其转录活性

图7 | GmRR11d是大豆GmNARK的下游调控因子

文章总结

本研究通过酵母双杂交筛选到了一种结瘤调控相关蛋白——B型反应调节因子GmRR11d，并且建立了一种GmRR11d在结瘤自主调控系统中的工作模型（图7i)。即在低氮条件下，根瘤菌侵染大豆，GmRR11d水平较低，CK水平适合结瘤，GmNSP1s与GmNSP2复合物激活的表达，促进结瘤形成和结瘤的自动调节（AON）；感染后期，AON的激活，促使GmNARK诱导表达，GmRR11d同时诱导CK超敏反应及抑制表达和NF信号通路，阻断根瘤菌感染，抑制根瘤的进一步形成。本研究对理解大豆根瘤共生系统，解析大豆固氮效率调控机制，指导高效固氮植物育种具有重要意义。

华中农业大学在读博士生陈嘉欢为本文第一作者，华中农业大学王志娟副教授、山西农业大学王利祥教授为共同第一作者，李霞教授为通讯作者。德国海德堡大学的Chao Su博士和Thomas Ott教授也参与了该项工作。该研究工作得到了国家自然科学基金、华中农业大学校自主科技创新基金、湖北省自然科学基金的支持及岭南实验室基金支持。

项目中所用的大豆根瘤酵母文库由欧易生物构建。

Doi：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35360-9

猜你想看

1、Current Biology│中科院分子植物卓越中心发现果蝇的行为防御机制

2、项目文章 | 单细胞测序揭示囊型包虫病不同阶段内皮细胞和免疫细胞异质性

3、项目文章 | 单细胞测序揭示来源于激活血管平滑肌的细胞外捕捉驱动动脉粥样硬化的进展

4、项目文章 | 湖南大学赵小英/何崇圣团队发现拟南芥蓝光受体CRY1调控m6A修饰和光形态建成分子机制

END

排版人：小久

原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。

点击“阅读全文” 收获更多精彩