茎环法or加尾法？哪种更适合你的miRNA检测？

前面小编介绍了正确查找、确定miRNA成熟体序列的方法。在miRNA的研究中免不了要检测目标miRNA的表达情况，但众所周知miRNA成熟体的长度仅20~25个核苷酸，常规qPCR引物设计方法不适于miRNA的qPCR检测，那么miRNA的逆转录和qPCR引物设计应该如何进行呢？

下面汉恒生物小编就为大家介绍一下目前常用的两种方法：茎环法和加尾法，两种方法的原理都是通过在逆转录时增加逆转录产物长度，经上述两种方法处理后，得到的cDNA长度可从原始的20nt增加到80nt以上，这样即可实现miRNA的qPCR扩增。

茎环法

茎环法需要设计3个引物：逆转录引物以及用于qPCR的一对检测引物

逆转录引物：

通用的茎环序列+5~8个与目的miRNA的3'端反向互补的碱基。通用的茎环序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

以hsa-miR-378a-3p（MIMAT0000732）为例，该成熟体序列为：

ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC（3'端6碱基）

3'端6碱基反向互补序列：GCCTTC

hsa-miR-378a-3p的茎环法逆转引物则为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCTTC

作用原理：茎环结构的逆转录引物与miRNA 分子的3'端结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的 miRNA 第一链 cDNA。

qPCR检测引物：

正向引物F：根据miRNA的序列设计，一般是用除去3'端6个碱基的剩余部分作为正向引物，若GC含量较低，可在5'端增加G/C进行调整，使引物Tm值接近60℃。

反向引物R：为通用引物，一般选取茎环结构中的一部分，常用序列：GTGCAGGGTCCGAGGT 或ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG

hsa-miR-378a-3p的qPCR检测引物：

F：GACTGGACTTGGAGTCA（设计出Tm值偏小，故在5'端加一个G）

R：GTGCAGGGTCCGAGGT

加尾法

加尾法由两个酶共同作用完成：PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。其过程如下：

加尾法逆转录引物：

3'端存在1-2个锚定碱基的Oligo dT（miRNA加尾法逆转录试剂盒自带），锚定碱基可特异性地结合到miRNA上，从而让逆转录引物结合到紧挨着miRNA的那段PolyA序列上。

加尾法qPCR检测引物：

miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法的逆转录产物5'端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R，试剂盒自带)。

正向引物则可将成熟miRNA的序列作为模板进行设计（与茎环法类似）。

两种方法如何选择：

若检测需要较高的灵敏性和特异性，可以考虑茎环法；另外，在检测通量上，茎环法属于特异性逆转录，一次逆转录只能检测一个miRNA；加尾法可对抽提纯化的miRNA进行无差别，属于高通量逆转录，一次逆转录可检测多种miRNA。另外miRNA加尾法逆转录是无法使用普通的逆转录试剂盒进行逆转录的，因为其过程需要PolyA聚合酶。但茎环法可使用常规的mRNA逆转录试剂盒，但是需要注意的是，逆转录引物要使用特异的茎环引物，而不是试剂盒中的随机引物和Oligo dT引物。 

以上即为两种miRNA的qPCR检测方法，如果有其他的疑问，欢迎咨询汉恒生物！