RNA免疫沉淀 (RIP) 实验方案介绍及注意事项
上周上传了Co-IP（免疫共沉淀实验）技术视频的课件，反响还不错，有同学留言想看RIP实验流程，今天这篇文章就展开讲讲RIP实验流程！
在这篇文章中，你可以查找进行RIP实验所需要的一切，包括一份正确试剂的列表以及实验方案每个步骤的疑难解答提示。
RIP技术定义
RIP是一种基于抗体的技术，用于定位体内的 RNA-蛋白质相互作用。将所关注的 RNA 结合蛋白 (RBP) 与其结合的 RNA 一起进行免疫沉淀，然后鉴定结合的 RNA（mRNA、非编码 RNA 或病毒 RNA）。结合的 RNA 可以通过实时 PCR、微阵列或测序的方法进行检测。
最近，表观遗传学和 RNA 生物学领域对不同 RNA 作用和功能的关注大大增加。据观察，RNA 的功能远不止转录和后续的翻译。例如，RNA-蛋白质相互作用能够调控 mRNA 和非编码 RNA 的功能。对 RNA 潜能的这一新认识带动了新方法的发展，使研究人员能够定位 RNA-蛋白质相互作用。RIP 是一种研究单个蛋白质和 RNA 分子间物理结合的实验方案。
RIP实验基本原理
1、用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的 RNA 结合蛋白。
2、防止非特异性的 RNA 的结合。
3、免疫沉淀把 RNA 结合蛋白及其结合的 RNA 一起分离出来。
4、结合的 RNA 序列通过 microarray(RIP-Chip)，定量 RT-PCR 或高通量测序(RIP-Seq) 方法来鉴定。
RIP实验基本步骤
一、细胞裂解液获取
A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
1、冷 PBS 清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次；
2、加入冷 PBS 后用细胞刮将细胞刮下来，收集至 enpendoff 管；
3 、1500 rpm ，4℃离心 5 min，弃上清，收集细胞；
4、用与细胞等体积的 RIP 裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置 5 min；
5、每管分装 200 μl 细胞裂解液，贮存于-80℃。
B. 悬浮细胞处理
先收集细胞再计数，然后清洗裂解。
C. 组织样品处理
1、冷 PBS 清洗新鲜切下的组织三次；
2、加入冷 PBS 后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数；
3 、1500 rpm ，4℃离心 5 min，弃上清，收集细胞；
4、用与细胞等体积的 RIP 裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置 5 min；
5、每管分装 200 μl 细胞裂解液，贮存于-80℃。
二. 磁珠的准备
A. 实验前准备
1 、enpendoff 管
2、磁力架
3、冰盒， RIP Wash Buffer 置于冰上
4、抗体，置于冰上
5、涡旋震荡器
6、枪、枪头放于超净台照射 30min，枪喷 DEPC 水
B. 磁珠准备过程
1、重悬磁珠
2、标记实验所需的 enpendoff 管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照；
3、吸取 50 μl 重悬后的磁珠悬液于每个 enpendoff 管；
4、每管加入 500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡；
5、将 enpendoff 管置于磁力架上，并左右转动 15°使磁珠吸附成一条直线，去上清， 重复一次；
6、用 100 μl 的 RIP Wash Buffer 重悬磁珠，加入约 5 μg 相应抗体于每个样品中；
7、室温孵育 30 min；
8、将 enpendoff 管置于磁力架上，弃上清；
9、加入 500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次；
10、加入 500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。
三. RNA 结合蛋白免疫沉淀
A. 准备工作
1、冰盒
2 、360°旋转仪
3 、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA 结合蛋白免疫沉淀实验过程
1、准备 RIP Immunoprecipitation Buffer；
2、将前上步的 enpendoff 管放磁力架上，去上清，每管加入 900 μl RIP Immunoprecipitation Buffer；
3、迅速解冻第一步制备的细胞裂解液， 14,000 rpm ，4℃离心 10 min。吸取 100 μl 上清 液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为 1 ml；
4 、4℃孵育 3 h 至过夜；
5、短暂离心，将 enpendoff 管放在磁力架上，弃上清；
6、加入 500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将 enpendoff 管放在磁力架上， 弃上清， 重 复清洗 6 次；
四、 RNA 纯化
A. 实验前准备
1 、枪、枪头、enpendoff 管紫外照射 30min，喷 DEPC 水以除 RNA 酶；
2、Salt Solution Ⅰ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS 、 Precipitate Enhancer 置于冰上；
3 、RNase-free 的乙醇、氯仿、异戊醇；
4 、4.DEPC 水置于冰上；
5 、5. 离心机预冷；
6 、6. 冰盒。
B. RNA 纯化过程
1、准备 Proteinase K Buffer。每个样品需 150 μl；
2、用 150 μl Proteinase K Buffer 重悬上述磁珠-抗体复合物；
3 、55℃孵育 30 min；
4、孵育完之后，将 enpendoff 管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff 管中；
5、于每管上清液中加入 250 μl RIP Wash Buffer；
6、于每管加入 400 μl 苯酚：氯仿： 异戊醇， 涡旋震荡 15 s ，室温下 14,000 rpm 离心 10 min；
7、小心的吸取 350 μl 上层水相，吸入另一新的enpendoff 管；
8、于每管加入 400 μl 氯仿，涡旋震荡 15 s ，室温下 14,000 rpm 离心 10 min；
9、小心的吸取 300 μl 上层水相，吸入另一新的enpendoff 管；
10、每管加入 50 μl Salt Solution Ⅰ，15 μl Salt SolutionⅡ, 5 μl Precipitate Enhancer ，850 μl 无水乙醇(无 RNase)，混合， -80℃保持 1 h 至过夜；
11 、14,000 rpm ，4℃离心 30 min，小心去上清；
12、用 80%乙醇冲洗一次， 14,000 rpm ，4℃离心 15 min，小心去上清，空气中晾干；
13 、10-20 μl DEPC 水溶解， -80℃保存，送测序。
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1 、RIP 试验需要注意什么?
2、为什么抗体无法沉淀 RIP 裂解液中的目标蛋白?
3、提取 RNA 时，蛋白酶 k 消化不完全是什么原因?
4、提取 RNA 后， A260/A280 比值偏离 1.8~2.2 区域是什么原因?
5、做 RIP 的时候和 beads 孵育的lysate 的浓度如何确定? 有些动物的文献提到用细胞 板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应 50 ulBEADS?
6、RIP 可以分提核浆的 RNA-蛋白质复合物吗?
7、因为 RIP 做完得到的是 RNA 序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置
等，是不是都必须要做 RT-PCR，得到逆转录的 DNA 后，后面就跟 ChIP 相同了？
