流式细胞术在各个领域的强大应用，看看你知道几个！

流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是一种基于单细胞水平、多参数分析分选的强大工具，在免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病监测等领域发挥着重要作用。本文对其在各领域应用做个整体简单介绍，分类归属并无限制性，任何一个技术都可以在其他领域使用。

一、免疫学

#1 免疫表型

免疫表型分析是流式细胞术中最常用的应用。
它利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数。用针对细胞表面抗原荧光抗体染色。大多数这些抗原被人类白细胞分化研讨会赋予“分化簇”编号或 CD 编号，以便使用通用命名法来定义针对特定细胞抗原的单克隆抗体。例如，CD3 是“3 号分化簇”，用于定义存在于所有 T 细胞上的 T 细胞共同受体。

大多数免疫细胞具有特定的 CD 标记物，将它们定义为细胞群。这些用于定义特定细胞群的细胞标记称为谱系标记，如 T 细胞标记（CD3、CD4、CD8）、B 细胞标记（CD19、CD20）、单核细胞标记（CD14、CD11b）和 NK 细胞标记（CD56、CD161）。

除了定义细胞群的谱系标记外，还使用其他标记来表征每个细胞群。这些标记可以包括激活标记（CD69、CD25、CD62L）、记忆标记（CD45RO、CD27）、组织归巢标记（α4/β7）和趋化因子受体标记（CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6）。通常，免疫表型实验还包括细胞内标记物，例如 FoxP3（定义 Treg细胞）、细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2 定义 TH1 细胞）、增殖标记物（Ki67、CFSE）和抗原特异性标记物（主要组织相容性或 MHC 四聚体）。当前的仪器和试剂能够进行多达40 种颜色的免疫表型分析实验，但是，在 12-15 种颜色范围内进行实验更为常见。

#2 抗原特异性反应

抗原特异性反应可以通过用特定抗原刺激细胞，然后通过 MHC 多聚体寻找细胞因子的产生、增殖、激活、记忆或抗原识别来测量。MHC 多聚体是 MHC 单体（MHC-I 或 MHC-II），它们通常被生物素化，然后以 4 个（四聚体）、5 个（五聚体）或 10 个（右聚体）为一组与荧光链霉亲和素骨架结合。这些 MHC 多聚体“装载”了选择的抗原，然后用于与识别该抗原的 T 细胞结合，从而表明对特定抗原的反应水平。此应用程序通常用于疫苗研究。

#3 细胞内细胞因子分析

细胞内细胞因子分析是通过用蛋白质转运抑制剂（Brefeldin A 或Monensin）处理细胞 2-12 小时来进行的，这样细胞产生的任何细胞因子都可以在细胞内积聚，从而实现更好的检测。在此孵育过程中，可以用各种抗原刺激细胞，例如来自疫苗的肽以测量免疫反应。

在蛋白质转运抑制剂处理后，对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色，然后固定和透化以使用抗细胞因子抗体进行细胞内染色。

#4 增殖分析

细胞增殖可以通过流式细胞术使用几种不同的测定和标记来测量。这些测定使用不同的方法来靶向增殖相关事件，例如将胸苷类似物 (BrdU) 掺入复制 DNA、示踪染料 (CFSE) 的世代跟踪以及增殖相关抗原 (Ki67、PCNA) 的表达。

相当于3H 胸苷增殖测定的流式细胞术利用胸苷类似物 BrdU 掺入生长细胞 2-6 小时。在此孵育之后，细胞进行表面标记染色（可选），然后固定并透化以对掺入的 BrdU 进行染色。BrdU 程序利用 DNase 暴露 BrdU 进行抗体染色。通常会用 DNA 结合染料（如PI）进行复染。此外，BrdU方法与其他细胞内抗原标记的染色兼容。

CFSE 和其他类似染料（CellTrace Violet、FarRed 等）穿过活细胞中的细胞膜并与细胞内结构（通常是赖氨酸或其他胺）共价和永久结合。每一代的子细胞都继承了染料，从而可以对增殖进行长期分析。这种技术在跟踪长期抗原刺激导致的增殖时非常有用。

增殖相关抗原的表达也可以用作增殖的标志物。Ki67 在细胞增殖（所有阶段）期间表达，但不在细胞静止期间表达。DNA复制需要PCNA（增殖细胞核抗原）。Ki67 或 PCNA 的存在是细胞增殖的指标。Ki67、PCNA 和 BrdU 对相同细胞的染色显示在图2.

#5 细胞凋亡分析

细胞凋亡或程序性细胞死亡是免疫学和其他研究领域中经常检查的一种现象。它用于通过去除细胞而不触发炎症反应（坏死）来维持免疫系统的稳态。它是免疫反应后克隆扩增的 T 细胞、自我靶向 T 细胞、自身反应性 B 细胞和免疫系统中的多个其他细胞的死亡机制。

通过流式细胞术检测细胞凋亡可靶向与细胞凋亡相关的级联事件的多个目标。质膜的易位-Annexin V染色，DNA的内切酶消化-TUNEL (TdT dUTP 缺口端标记) 测定，Caspases的活化-荧光抗体靶向，染料标记-线粒体膜电位变化，Hoescht 33342 染色-细胞核中的染色质凝聚。

Annexin V 是一种磷脂结合蛋白，与细胞凋亡过程中易位到细胞膜外层的磷脂酰丝氨酸结合。Annexin V  染色应使用活力排除染料（如PI）确认结合发生在细胞膜的外表面。

TUNEL 是一种利用末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 的能力，用 dUTP（脱氧尿苷三磷酸）或 BrdU 标记与细胞凋亡相关的 DNA 断裂末端的技术。dUTP 或 BrdU 用荧光染料标记以进行检测，并在数据采集之前用 DNA 染料对细胞进行染色。

在大多数细胞凋亡情况下，caspase 信号通路被激活。使用针对 caspase 3 活性形式荧光抗体胞内染色测量。还有其他检测方法利用荧光底物，当暴露于caspase 活性时会被切割，然后发出荧光。

线粒体凋亡并不总是利用 caspase 途径，因此需使用不同的方法进行检测。这些方法中的大多数检查线粒体膜电位，例如使用染料 JC-1。然而，有一种针对 APO2.7 的抗体位于线粒体膜上，仅在细胞凋亡期间表达。

二、分子生物学

#1 荧光蛋白分析

荧光蛋白（GFP、mCherry、YFP、mRuby 等）用作蛋白质表达的标记。通常，细胞用含有启动子序列并编码感兴趣基因和荧光蛋白的质粒转染。荧光蛋白的表达用作目标基因表达的指标。最近，与其他蛋白质连接的分裂双或三部分荧光互补的表达允许检测RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法彻底改变了细胞的检测和分离，其中荧光仅在对替代物的反应中检测(Han et al., 2014)。该技术有多种应用，例如体内跟踪移植细胞、细菌或病毒感染以及细胞中的基因敲除，以进一步阐明基因功能。

#2 细胞周期分析

细胞周期分析测定包括用饱和量的 DNA 结合染料染色 DNA。在大多数情况下，细胞用 70% 乙醇溶液固定，该溶液可渗透细胞，然后用染料（PI、7AAD、DAPI）染色。但是，有些染料可以进入活细胞并对 DNA 染色而不会对细胞造成伤害，例如 Hoescht 33342。在这种类型的分析中，以线性放大的低流速采集样品，然后使用倍性建模软件进行分析以确定细胞周期阶段。

#3 信号转导流式细胞术

该应用使用针对静止和磷酸化信号分子的荧光抗体染色。通常有匹配的专用缓冲液可以研究混合细胞群中的信号通路。

#4 RNA 流式细胞术

RNA 流式细胞术将流式细胞术与荧光原位杂交 (FISH)相结合，以同时检测 RNA 表达和蛋白质表达。该技术需要染色方案优化，因为并非所有荧光染料偶联抗体都能在 40°C 下进行多次 1 小时孵育。当找不到合适的靶标抗体时，改为检测对应 RNA 表达，这是一种有用的技术。

三、细胞分选

细胞分选利用具有细胞分选功能的流式细胞仪来分离和纯化细胞或颗粒以进行进一步分析。本质上，任何分析时找到的任何细胞或颗粒都可以通过细胞分选仪进行分离。细胞可以分选到 96 或 384 孔板、管和载玻片中。一些常见类型的样品是表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群。任何细胞分选的一个主要考虑因素是增加染色大量细胞所需的抗体量。

四、其他应用

#1 绝对细胞计数

绝对细胞计数可以添加到任何免疫表型实验中。该过程利用与样品一起获得的已知浓度的荧光微球。对样品进行分析，并将感兴趣群体的门控细胞数量与在同一样品中获得的微球数量进行比较，以获知每毫升的细胞数量。

#2 定量流式细胞术

定量流式细胞术使用基于微球的标准品来生成已知荧光量的染色曲线。然后使用相同的仪器设置获取细胞，并使用线性回归分析来计算细胞上的荧光量。根据所使用的微球系统，这可以表示为每个细胞结合的抗体 (ABC)、抗体结合能力 (ABC) 或等效可溶性荧光染料分子 (MESF)。最适合此应用的荧光染料是 PE，因为它的大小，几乎总是以 1:1 的荧光染料与蛋白质比率与抗体结合。可溶性荧光分子当量 (MESF) 标准可用于将任意荧光强度测量值转换为荧光分子的数量，方法是在任何特定实验中生成标准曲线并从 MESF 微球数据回归；

#3 多重微珠阵列检测 

多重微珠阵列检测是用针对特定可溶性蛋白质或核酸的抗体包被的微球组。每个微球都有一个已知量的荧光和一个特定的目标，它给出了微球在矩阵中的位置。多达 100 种微球的集合与感兴趣的样品一起孵育，用荧光报告分子标记，然后在流式细胞仪上采集，使用特殊软件根据微球定位以及报告荧光信号强度计算分析物的量。

#4 吞噬作用测定

使用荧光标记的生物颗粒或细菌，可以使用流式细胞术检测吞噬作用。细菌用 pH 敏感染料标记，只有在暴露于吞噬体的较低 pH 值时才会发出荧光，表明细菌被吞噬了。

#5 小颗粒分析与分选

使用灵敏度更高的流式细胞仪，可以检测和分选外泌体和其他亚微米颗粒。细外泌体、病毒和其他亚细胞颗粒的分析在多个领域创造了新的应用，包括癌症生物学、癌症治疗和疫苗开发。该技术仍处于开发阶段，但技术和仪器正在迅速改进，以便在不久的将来更容易使用该应用程序。

Reference
McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview. Curr Protoc Immunol. 2018;

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