双热点分析思路再度来袭！铁死亡+EMT强强联合，常规预后模型思路也能轻松入手8分+纯生
单个疾病的生信没新意，可以分析双疾病！
同理，单一热点已经看腻了，可以通过双热点创新升级！
还有分析铁死亡和EMT状态的方法等你来看！
小云之前推荐的双疾病思路大家都很感兴趣。
这次小云再强力推荐双热点的分析思路，希望给你的国自然课题助力！
因为不论是实验还是生信文章，双热点都要比单一热点要增色不少。那么从生信出发就分析双热点，筛选出关键基因，后续设计“双热点”的课题思路也就水到渠成了~
（不知道如何找双热点或创新升级的可以找小云，各种个性化分析思路等你来挑~）
双热点的生信思路有哪些优势呢？
1. 单一热点的风险评分比较常见，双热点会给人眼前一亮的感觉；
2. 大多数热点方向都已经有生信文章发表了，比如铁死亡、氧化应激、EMT，突破较难，双热点就可以轻松创新升级；
3. 后续的课题思路依然可以设计成双热点~
小云觉得双热点是个不错的分析思路，而且热点/潜在的热点方向那么多，能做的分析思路太多了，建议大家快速上车，先拿下1-2篇生信文章，再设计后续“双热点”的课题思路。
不过也要注意，不是随便两个热点就能进行分析了，它们之间还是要有一定关联的，比如小云今天分享的这篇的“铁死亡”和“EMT”的双热点生信文章。
研究表明，EMT过程中ZEB1的激活促进了多不饱和脂肪酸(PUFA)的合成，而PUFA的代谢依赖于GPX4。这使得肿瘤细胞容易受到铁死亡的影响。HDAC抑制剂治疗可以诱导EMT，并通过改变细胞内铁水平来增加对铁死亡的敏感性。这些研究都说明了”铁死亡”和“EMT”之间存在潜在联系。
那么，同时分析这两个热点，形成双热点生信思路就手到擒来了！赶快来看看吧~
题目：基于铁死亡和EMT状态的肝细胞癌预后预测和免疫浸润分析
杂志：Frontiers in immunology
影响因子：8.786
发表时间：2022年12月
研究思路
从TCGA和ICGC数据库下载肝癌患者的基因表达和临床数据，分别用于预后模型的构建和验证。采用最小绝对收缩和选择算子(LASSO) Cox回归构建预后模型，通过Kaplan-Meier生存分析和受试者工作特征(ROC)曲线评估模型的预测能力。通过表达谱分析评估铁死亡和EMT状态。采用CIBERSORT和单样本基因集富集分析(ssGSEA)方法进行免疫浸润分析。最后，构建了一个包含FEPM评分和TNM分期的nomogram用于预测预后。
主要研究结果
1. 筛选关键的ERGs和FRGs用于构建预后模型
将1208个ERGs和FRGs，与TCGA数据分析出的差异表达基因(DEGs)取交集，获得336个基因 (图1A, B)。单变量Cox回归分析确定了38个预后相关基因，构建PPI网络显示FRGs和ERGs之间的相互作用(图1C)。LASSO Cox回归分析确定了铁死亡和EMT相关预后模型(FEPM)的13个关键基因(图1D, E)。13个基因的表达如热图所示(图F)，其中有9个ERGs，3个FRGs， 1个基因(SQSTM1)同时属于ERGs和FRGs。
图1.筛选预后模型的关键基因
2. 计算风险评分
以中位风险评分为临界值(图2A)，将TCGA队列分为高FEPM组和低FEPM组。Kaplan-Meier曲线显示，高FEPM组患者的总生存期明显较短(图2C)。风险评分较高的患者死亡较早，生存时间较短(图2B)。根据时间相关的ROC曲线，1年曲线下面积(AUC)为0.820,3年为0.753,5年为0.737(图2D)。
图2.TCGA队列中FEPM的生存分析
3. ICGC队列验证预后模型
根据TCGA队列的相同计算方法计算风险评分，将ICGC队列分为高FEPM组和低FEPM组，得到类似的结果。
4. FEPM评分是一个独立的预后因素
热图显示这13个关键基因在TCGA队列的两个亚组中表达水平不同(图4A)。
将FEPM评分和临床病理特征作为预测因素进行单变量Cox回归分析。森林图显示，无论是在TCGA队列或ICGC队列中，FEPM评分都是HCC患者预后的重要危险因素 (图4B, D)。将具有统计学意义的预测因素进行多变量Cox回归分析，发现FEPM评分是HCC患者的独立预后因素 (图4C, E)。
图4.热图、单因素和多因素Cox回归分析
5. 铁死亡及EMT状态分析
为了分析铁死亡的状态，作者对比了两个亚组中16个铁死亡抑制因子(SOFs)的表达谱。在TCGA队列中，高FEPM组中所有这些SOFs的表达均显著上调(图5A)。在ICGC队列的高FEPM组中，大多数SOFs的表达水平也较高(图5B)。说明高fepm组似乎具有抑制性铁死亡的状态。在TCGA队列中进行GSEA，发现在低FEPM组中，许多与铁死亡相关的代谢途径显著增强(图5E)。
为了分析EMT状态，作者比较了14个上皮标记物、间充质标记物和EMT转录因子（EMT-TF）在不同组间的表达。在TCGA队列中，高FEPM组间充质标志物和EMT-TF的表达显著增加(图5C)。在ICGC队列中，高FEPM组间充质标志物的表达也显著升高(图5D)。说明高FEPM组有更积极的EMT状态。
6. 肿瘤免疫微环境分析
利用ssGSEA计算TCGA队列中免疫细胞的富集评分，通过聚类分析的方法确定了高免疫浸润聚类和低免疫浸润聚类两个亚型(图6A)。CIBERSORT分析显示，高FEPM组Tregs等浸润水平较高。
图6. 肿瘤免疫微环境分析
ssGSEA分析发现骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(Tregs)等免疫抑制细胞显著上调(图7A, B)。此外，免疫检查点分子在高FEPM组高表达(图7C-J)。
图7. (A, B) ssGSEA富集评分；(C-J)免疫检查点分子的表达
7. 构建nomogram并评估其预测效果
Nomogram纳入两个独立的预后因素，包括FEPM评分和TNM分期(图8A)。时间相关的ROC曲线表明了其良好的敏感性和特异性。
图8.Nomogram和ROC曲线
校准曲线进一步显示，nomogram预测值与实际值高度一致。决策曲线分析(DCA)显示nomogram可在较宽的阈值范围内提供临床获益。
图9.校准曲线和决策曲线分析
总结
这篇文章的亮点就是基于铁死亡和EMT进行了双热点的生信分析，之后的预后模型、构建风险评分、分析不同风险组患者肿瘤微环境、构建nomogram等均为常规分析。常规思路的纯生信也能轻松发表8分+，性价比超高！
除了双热点的分析思路，还可以借鉴作者分析铁死亡状态和EMT状态的方法~。
如果你还苦恼于生信分析没有思路，或者嫌分析方法太过简单、太过老套，想要创新思路的，或者对EMT、铁死亡等热点方向感兴趣的小伙伴快来联系小云吧！
