组培苗的壮苗与培养，组培技术教学，组培室建设步骤，组培生产预算 组培设备，组培架

在试管苗增殖到一定数量时，就要使部分组培苗分流进入到壮苗与生根阶段。若不能将培养物大量转移到生根培养基上，就会使长时间不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而导致无效苗增多，最后被迫淘汰许多材料。

 

壮苗培养

在继代培养过程中，细胞分裂素浓度的增加有助于增殖系数的提高。但伴随着增殖系数的提高，增殖的芽往往会出现生长势减弱，不定芽短小、细弱，无法进行生根培养的现象；即使能够生根，移栽成活率也不高，必须经过壮苗培养。壮苗培养时，可将生长较好的芽分成单株培养，而将一些尚未成型的芽分成几个芽丛培养。

 

选择适宜的细胞分裂素和生长素（种类及不同浓度配比），可以同时满足增殖和壮苗的不同要求。如在杜鹃快繁的研究中发现，ZT/IAA或ZT/IBA的比值升高，芽的繁殖系数也随之增加，但壮苗效果却降低。高浓度的生长素和低浓度的细胞分裂素的组合有利于形成壮苗。因此，在以丛生芽方式进行增殖时，适当降低培养基中细胞分裂素的浓度，并增加NAA等生长素的浓度，就能达到壮苗培养的目的。在实际生产中，我们一般用较低浓度的细胞分裂素与生长素组成合理的比列，将有效增殖系数控制在3.0-5.0，以实现增殖和壮苗的双重目的。

 

生根培养

1、试管内生根

试管内生根是将成丛的试管苗分离成单苗，转接到生根培养基上，在培养容器内诱导生根的方法。试管苗生根的优劣主要体现在根系质量（粗度、长度）和根系数量（条数）吸收方面。不仅要求不定根比较粗壮，更重要的是要有较多的毛细根，以扩大根系的吸收面积，增强根系的吸收能力，提高移栽成活率。根系的长度不宜太长，在粗而少与细而多之间，可能以后者较好。

 

生根阶段可对培养基成分和培养条件进行调整，减少试管苗对异养条件的依赖，逐步增强光合作用的能力。对于大多数物种来说，诱导生根需要有适当的生长素，其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0.1-10.0mg/L。但唐菖蒲、水仙和草莓等组培苗很容易在无生长素的培养基上生根。

 

一般情况下矿质元素浓度较高时有利于茎、叶生长；较低时有利于生根。生根培养基中无机盐和蔗糖浓度减少一半，光照强度由原来的500-1000lx提高到1000-5000lx，能刺激小植株自身进行光合作用制造有机物，以便由异养型向自养型过渡。在这种条件下，植物能较好的生根，对水分胁迫和疾病的抗性也会有所增强，植株可能表现出生长迟缓和较轻微的失绿。但生产实践证明，这样的幼苗，要比在低光强条件下的着绿较高的幼苗移栽成活率高。

 

生根阶段采用自然光照比灯光照明所形成的试管苗更能适应外界环境条件。培养基中添加活性炭有利于提高生根苗质量。例如在樱花生根培养基中加入0.1%-0.2%活性炭后，试管苗不仅生长健壮，无愈伤组织，而且根系较长、白色、有韧性，移栽后新根发生快，质量好，成活率高。

 

2、试管外生根

有些植物种类在试管中难以生根，或有根但与茎的维管束不相通，或根与茎联系差，或有根而无根毛，或吸收功能极弱，移栽后不宜成活，这就需要采用试管外生根法。试管外生根是将已经完成壮苗培养的小苗，用一定浓度生长素或生根粉浸蘸处理，然后栽入疏松透气的基质中。例如大花蕙兰、非洲菊、苹果、猕猴桃、葡萄和毛白杨等均有试管外生根成功的报道。试管外生根也是一种降低生产成本的有效措施，不仅可以减少无菌操作的工时消耗，而且减少了培养基制备材料与能源消耗。

组培室的筹建

组培室建设首要考虑的问题就是组培室需要哪些设备条件和需要什么样的培养条件。对这些有了全面了解以后，我们便可以因地制宜地新建或利用现有房屋建设实验室。在设计组培室时，一般情况应按组培的流程来设计，同时考虑人物分流顺畅，空间合理利用。植物组织培养要求严格的无菌的条件，需要一定专业仪器设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

实验室

一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、配置室、接种室、培养室、观察室（冷却室）、灭菌室、洗苗室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。

（一）洗涤室　

洗涤室完成玻璃器皿和其它仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，用于培养器皿的洗涤，最好是内衬白瓷砖的水泥槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺橡胶板，上下水道要畅通。备有大型塑料筐，用于放置培养器皿。可直接置于搁架上，以节约空间和便于运输工作。备有空干架，以空干涮净的培养器皿。

（二）配置室、灭菌室（可分开）

准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。

为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：

1．工作台

其高度应方便配制工作。

2．药品柜

用以放置常用药品。

3．普通冰箱

主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。

4．电子分析天平和托盘天平

电子分析天平精确度为0.001g，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品；托盘天平精确度为0.1g，用于称取用量较大的糖和琼脂等。天平应放置在干燥、不受振动的固定操作台上。

5．纯水仪或电蒸馏水器

纯水仪提供纯水，水质好。电蒸馏水器， 采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。

6．磁力搅拌器　　

磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等 。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。

7．恒温水浴锅或恒温振荡水浴

水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。若没有水浴锅，也可用1500或2000W电炉或电饭锅代替。电炉应配有铝锅。

8．酸度计　

组织培养中培养基pＨ值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pＨ时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pＨ计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。

9．培养基分装设备

小型组织培养实验室可采用烧杯、漏斗等作为分装培养基的工具。也可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合用。更大规模或要求更率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。

10．高压灭菌锅

用以进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。

11．烘箱

用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80～100℃；进行干热灭菌需保持150℃，达１～３小时；若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干。

12．恒温培养箱

内有温度调节器，生化培养箱还配有光源，用于植物材料的培养。　

（三）接种室

接种室是是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。

在工作方便的前提下，无菌操作室宜小不宜大，一般7～8m2；要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光洁，易于清洁和消毒。无菌操作室应配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。

无菌操作室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装1～2盏紫外线灭菌灯，用以经常地照射灭菌。最好能安置一小型空调，使室温可控，这样可让门窗紧闭，减少与外界空气对流。

无菌操作室应设有缓冲间，面积2 m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外灭菌灯，用以照射灭菌。

无菌操作室的主要设备及用具有：

1．接种箱　

在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。

2．超净工作台　

超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。并可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。

3．无菌操作用的器具

按单人超净台上的用量计：酒精灯1个；20～25cm长的医用镊子1把；4号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；500ml广口瓶1只，内放酒精，现代专业组培室多用接种器械灭菌器和容器口灭菌器，用于浸泡镊子、刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架。

4．搁架

贮放高压灭菌后等待接种的培养基。

（四）培养室

是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要的培养架的大小、数目、及其它附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。

培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设6层。最低一层离地高约10厘米，其它每层间隔30厘米左右，培养架即高1.8米左右。培养架长度，因一般在每层上端装置日光灯,以供照明，所以都是根据日光灯的长度而设计，如采用28W日光灯，则长1.25m，21 W的长１米即可。宽度一般为50cm。

培养室最重要的因子是温度，一般保持在20～27℃左右，可安装窗式或立式空调机。要求温度因热带植物和寒带植物等的种类不同而异，最好不同种类有不同的培养室。

室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70～80%为好,可安装加湿器。

培养架上装置日光灯时，可安装定时开关钟控制照明时间，植物组织培养的光照强度一般在1000～4000勒克斯（lux），每天照明10～16小时，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。

现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为能源，这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天用灯光作补充。

补光光源目前专业的组培室用全光谱冷光灯或led组培专用灯。

第二、 设备和器材

（一）玻璃器皿

在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿.其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。

最常使用的是三角瓶，规格有100、250、500毫升等， 一般使用100毫升三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。

培养皿常用9、12厘米直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、 原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。

试管常用口径18×180 mm或20×200mm规格。可用于培养较高的试管苗 ，另外也不易污染。

培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml左右罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。

目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可增加培养的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时是非常方便的。

瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。现在多采用聚丙烯塑料膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口材料如封口膜。

在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括100、250、1000毫升烧杯；100、1000毫升量筒；100、1000毫升试剂瓶（棕色）等等。

（二）器械用具

１．镊子类

主要采用医疗上用的镊子。根据操作的需要有各种类型，若用100毫升的三角瓶作为培养瓶， 可用２20厘米长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口， 造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。某些微小部分的精细操作则用钟表镊子， 如在分离茎尖幼叶时，由于其尖端锋利，所以几乎可代替剪刀使用。

２．剪刀类

可采用五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。

3．解剖刀

切割较小材料时可用解剖刀。 分离茎尖分生组织，有时也用解剖刀。常用的解剖刀刀片可以经常调换，刀口要保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。

４．解剖针

解剖针用于深入到培养瓶中， 转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶。

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