「青莲聚焦」蛋白质组学FAQ蛋白产品相关问题（四）

蛋白质组学（英语：proteomics，又译作蛋白质体学），是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。这个概念最早是在1994年，由Marc Wikins首先提出的新名词。

上次分享了蛋白产品相关问题（三），本周二将分享蛋白产品相关问题（四）~

现在小编将带您进入今日主题

16. 通过 iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白，如何挑选验证？

答案：大规模的组学数据需要后期具体的验证实验，以支持组学数据和结论的可信度、说服力，也可以进一步提供文章发表的档次。可以从如下几个方面进行选择：

a) 研究相关的文献报道，已知与该研究课题密切相关的蛋白质进行进一步的研究；b) 优先挑选蛋白质组学定量差异倍数较大的蛋白进行研究；c) 挑选鉴定到的差异蛋白中unique peptide 数量相对多的蛋白进行研究（unique peptide 数量越多，可信度越高）、d) 挑选组间平行性好的，表达趋势一致的蛋白进行进一步研究（趋势越一致，说明蛋白变化越可信）e) 结合功能分析或通路分析（生物信息学的分析范畴），筛选得到的有意义的蛋白进行研究

17. 通过iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白，如何进行进一步的验证？

答案：验证方法很多，如Western blot、Elisa 、PRM(平行反应监测)，该方法是基于靶向的蛋白质组学，研究特定蛋白的表达变化。也可以用代谢组学，基因组学等多组学互相验证。

18. 通过 iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白，为什么后续验证不出来？

答案：可以从以下几个方面考虑：

A、选择验证的目标是否合理, 实验是否具有重复性和可靠性；B、蛋白修饰水平的验证是否具有时效性；不同阶段如基因水平到蛋白质水平的验证可能会有表达差异；大规模数据的筛选会存在一定的假阳性。

19. 为什么通过 Elisa、WB 能检测到的蛋白在 iTRAQ/TMT 或蛋白鉴定实验中没有检测到？

答案：western blot检测是将目的蛋白质信号放大很多级之后进行检测的，灵敏度很高，（除非特异性结合之外）专一性强，特异性检测目标蛋白，几乎不受复杂样品中背景蛋白质丰度的影响。对于纯蛋白质样品，质谱检测的灵敏度达fmol 水平。但在复杂样品中，质谱不是专一性检测的，而是选择样品中丰度较高的蛋白质优先检测，而丰度较低的蛋白质则因为肽段信号过弱被淹没而不能被检测到。因此，如果样品中待检测的目标蛋白质丰度较低（或者蛋白质分子量较小），即使 WB 能够检测到，质谱并不一定能检测到。

20. 为什么DIA无需进行高丰度去除、无需分级？

答案：DIA是一种全扫描技术，是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中所有离子进行选择、碎裂及检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。因此DIA在获得更高覆盖度信息的前提下，还尽可能减少高丰度蛋白对质谱扫描的影响。

本周的FAQ就到此结束啦~

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