一个非常非常简短的CRISPR-Cas9介绍

l  CRISPR序列与Cas蛋白

CRISPR-Cas系统是“成簇有规律间插短回文重复序列相关系统”的英文首字母简写，它包括CRISPR序列与Cas蛋白两部分，前者主要用于储存外来的核酸序列，而后者是一整个蛋白家族，具多种核酸相关的活性。

CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古菌体内，用于切断并沉默外来基因，行使类似多细胞生物中获得性免疫的功能。虽然CRISPR-Cas系统普遍高度保守，但在不同的生物中仍存在不同类型的CRISPR-Cas系统，大致可分为ⅠⅡⅢ三类，以其Cas5蛋白作为区分依据。

要想行使其功能，CRISPR-Cas系统必须得到含有核酸酶指导序列的RNA（crRNA）从而与Cas蛋白形成复合物，指导具有核酸酶活性的Cas蛋白对特定基因的剪切。在Ⅰ和Ⅲ型的CRISPR-Cas系统中，Cas6和Cas3蛋白直接作用于crRNA的前体以形成crRNA；而在Ⅱ型的CRISPR-Cas系中，由于不具Cas6，crRNA的合成依赖于核糖核酸酶Ⅲ对前体crRNA和反式crRNA的剪切，这样产生的crRNA会丢失部分碱基对。

l  作为基因编辑工具的CRISPR-Cas9

用于基因工程的CRISPR-Cas9来自于一种Ⅱ型CRISPR-Cas系统，属于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的SF370菌株。为何选择了Ⅱ型的CRISPR-Cas系统而非Ⅰ型和Ⅲ型？原因可能是Ⅱ型的CRISPR-Cas系统仅需Cas9一种多功能蛋白，从而使得操作更加简便。

由于之前提到的crRNA合成产生的碱基丢失问题，这里的野生型CRISPR-Cas系统其实不适用于细致的基因编辑。因此在作为基因编辑工具的CRISPR-Cas9中，指导Cas9剪切的RNA并不是原来的crRNA，而是经过人工设计的小向导RNA（sgRNA）。与sgRNA结合的cas9能够特异性地识别与sgRNA上间隔序列一致目标基因，从而达到对基因进行精确操作的要求。

在实际运用中，除了野生型的Cas9核酸酶（nucleases）还会用到经过人工设计的Cas9内切酶（nickases）。核酸酶作用的结果是双链断裂和非同源末端连接，在这个过程中会伴随一部分碱基对的丢失，因此Cas核酸酶往往只用于沉默目标基因或在其表达的酶活性中心引入缺刻等。而Cas9内切酶则可在体系内具有外源DNA的情况下导致高保真的同源定向修复，因而在基因编辑中更具价值。除Cas9外，较近的研究也使用Cpf1、C2c1、C2c2等酶作为更高效或适应不同情况的切割酶与sgRNA结合。

（运用就不写了_(:з」∠)_）