循序渐进，利用过表达和标签融合的免疫共沉淀Co-IP图片结果解读

今天小薇继续带大家来解读过表达的Co-IP（标签融合）图片。

PS：文末还有蛋白标签的小知识，欢迎翻阅~

文献实例：（PMID: 29368606，IF=41.444）

PKN2通过直接结合和激活DUSP6降低Erk1/2的磷酸化

背景简介

蛋白激酶N2（PKN2）是PKC相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作者实验中发现PKN2通过抑制Erk1/2磷酸化抑制IL4和IL10的表达。双特异性磷酸酶6 （DUSP6）是一种细胞质MAP激酶磷酸酶，可作为Erk1/2的抑制剂。然后免疫组化结果发现PKN2与DUSP6在人结肠癌组织中的表达呈显著正相关，且磷酸酶活性测定实验和转染/敲除PKN2后显示PKN2增加了结肠癌细胞系DUSP6的活性。然后作者通过CoIP实验对蛋白PKN2和DUSP6相互关系做了进一步验证（f，g图）。

方法描述

结果解读

三种细胞HCT116、SW480和HT-29中DUSP6和PKN2的Co-IP实验

与第一期的实验结果基本相同，左边实验组，阳性对照组和阴性对照组，右边蛋白DUSP6和PKN2的WB表达情况，上面代表不同细胞系。

实验组的实验结果阳性（可查看Input组，代表阳性结果），则可以证明两个蛋白DUSP6和PKN2存在相互关系。本文中可能input组中的PKN2在HCT116和SW480细胞中表达量较低。

所以，又做了两个蛋白过表达的Co-IP实验，这个就是小薇第一期最后说的那个解决办法。如果蛋白本身在细胞内表达量就比较低，不好检测出来（本文中的PKN2在HCT116和SW480细胞中表达量较低），针对这种情况建议就做一个过表达Co-IP实验。

一般来讲，非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（本文中的flag和HA标签）。

在293 T细胞中设置了不同剂量(0、3和6 μg) HA –标签的PKN2-WT（过表达PKN2），查看HA –PKN2-WT和 flag–DUSP6的共表达情况。

左边WB实验组（IP）、阳性对照组（Input），最上边细胞（293T细胞，人胚肾细胞），右上代表293T细胞单独或共转染各种质粒（vector-flag、vector-HA、PKN2-WT-HA和DUSP6-flag），也就是co-IP实验分为5组，分别是flag+HA标签组（阴性对照）、flag标签+PKN2-HA过表达载体、DUSP6-flag组、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA过表达载体以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA过表达载体。

首先观察input组，input组第一块胶图为利用anti-HA沉淀PKN2-HA标签，发现三个条带都在130kd处有蛋白，说明flag标签+PKN2-HA过表达载体、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA过表达载体以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA过表达载体三组中都存在PKN2-HA且其大小为130kd。input组第二块胶图为利用anti-flag沉淀DUSP6-flag标签，发现三个条带都在43kd处有蛋白，说明DUSP6-flag组、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA过表达载体以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA过表达载体三组中都存在DUSP6-flag且其大小为43kd。第三块胶图是内参基因GAPDH的条带。

其次来观察IP组，这组是利用anti-flag沉淀DUSP6-flag标签蛋白，最后发现DUSP6-flag组、DUSP6-flag+3μg PKN2-HA过表达载体以及DUSP6-flag+6μg PKN2-HA过表达载体三组凑可以沉淀下来DUSP6-flag复合蛋白。不同剂量的PKN2-HA蛋白对结果影响较大。

由此可以得到结论：两个蛋白都存在的时候，当DUSP6-flag蛋白被沉淀，PKN2-HA蛋白也会被共沉淀下来，PKN2蛋白与DUSP6蛋白之间存在相互作用，PKN2以剂量依赖的方式直接与DUSP6结合。

这里涉及到标签，简单做个小汇总。

标签蛋白的选择：

蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签，最为常用的是遗传标签，即His，Flag，GST，AviTag，c-Myc、HA等。

首先，需要确定融合标签的目的，蛋白纯化首选His-Tag，WB首选Flag-Tag，Co-IP可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc，活细胞成像则应该选择荧光蛋白等。

好了，两种比较经典的co-IP实验结果的图片解读今天就讲解完了。小薇提供语言润色、论文降重和专家评估，有需要的欢迎随时来撩~同事，有任何问题欢迎添加小薇VX随时沟通。