USP22去泛素化CD274以抑制抗癌免疫

写在前面

        今天推荐的是由浙江大学医学院在2019年8月9日发表于Cancer Immunology Research（2020IF：11.151，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Xueli Bai教授，研究表明USP22去泛素化CD274以抑制抗癌免疫。

研究背景

        PD-1(CD279)–PD-L1(CD274)抑制信号对于癌症免疫逃避至关重要，因此已成为抗癌免疫治疗的主要靶点之一。有几项研究证明了CD274的翻译后修饰对免疫失活和抑制的有效影响，例如泛素化、磷酸化、糖基化和棕榈酰化。然而，CD274去泛素化的调控机制仍不清楚。

摘要部分

        在这里，作者将泛素特异性蛋白酶22(USP22)鉴定为一种新型的CD274去泛素化酶。USP22直接与CD274的C末端相互作用，诱导其去泛素化和稳定化。在多种癌症类型中，USP22在肝癌中高表达，与这些患者的不良预后密切相关。USP22的基因缺失以免疫系统依赖性方式抑制肝癌生长，增加肿瘤免疫原性和肿瘤浸润淋巴细胞，并提高CD274靶向免疫疗法和基于CDDP的化疗对小鼠的治疗效果。作者证明靶向USP22是增强CD274扩增癌症的抗癌免疫的有前景的策略。

研究内容

1.USP22与CD274相互作用并阻止其通过去泛素化降解     

        为了研究CD274的降解是否能被DUBs逆转，作者使用广谱的DUB小分子抑制剂（PR-619）来处理稳定表达Flag-CD274的293T细胞，它以剂量和时间依赖的方式减少了CD274的表达。作者选择了几个高度敏感的DUB作为候选进行基于结合的小型化筛选，发现Flag-CD274与USP22特异性强相互作用。作者还通过不同细胞中的内源性免疫沉淀进行验证。使用纯化的重组蛋白进行的体外下拉分析表明USP22直接与CD274的C端的细胞质尾部和跨膜区结合。CD274在其C端具有三个不同的功能域；因此作者探究USP22结合的精确位点。共免疫沉淀结果强烈表明USP22与CD274的最后五个氨基酸（HLEET）相互作用。因为USP22是一种成熟的泛素特异性蛋白酶，作者认为CD274可能是其潜在的底物。作者在USP22扩增的HCC细胞系（HepG2）中通过CRISPR-Cas9介导的KO敲除了内源性USP22，三个该单克隆都表现出降低的CD274表达。相比之下，USP22的过表达导致CD274蛋白水平增加。

        鉴于CD274的稳定性受到细胞周期依赖性细胞周期蛋白D-CDK4激酶的负向调节，并且USP22也参与细胞周期进程，作者进一步测试了CDK4相关对USP22-CD274调节的影响。作者实验发现CDKN2A（细胞周期蛋白D-CDK4的上游抑制剂）或FZR1（细胞周期蛋白D-CDK4的下游衔接蛋白）的KD对USP22过表达导致的CD274上调没有影响。总之，这些数据表明USP22以独立于CDK4的方式稳定CD274。为了确定蛋白质保护作用是否取决于USP22的催化活性，将WT、无催化活性的突变体(C185A)和USP22的含UCH结构域(UCH)分别转染到USP22 KO HepG2细胞中。只有WT USP22的重新表达才能恢复USP22缺陷细胞中的CD274水平，这表明USP22通过其去泛素化相关的酶活性调节CD274蛋白的稳定性。为了了解USP22对CD274蛋白表达的积极影响，作者探究了USP22是否通过蛋白水解影响CD274降解。通过与MG132（蛋白酶体抑制剂）孵育，可以恢复USP22敲低或过度表达的细胞中改变的CD274水平。这些结果表明USP22阻止了CD274的蛋白酶体降解。与该结论一致，CD274的半衰期在USP22 KO细胞中显着缩短，但在USP22过表达细胞中大大延长。作者试图确定USP22是否催化了CD274的去泛素化并发现USP22敲低诱导体内泛素化CD274的增加，在回补USP22后大大减少。最后，去泛素化分析证实了WT USP22，而不是无活性的CA突变体，可以在体外直接去泛素化纯化的泛素化CD274蛋白。

研究结论：USP22是CD274的去泛素化蛋白酶。

2.USP22通过CD274抑制肿瘤免疫原性和抗肿瘤治疗   

        为了研究USP22-CD274轴的潜在病理生理学意义，作者生成了CD274过表达的USP22 KO细胞，以及USP22和CD274 DKO细胞。作者发现CD274的过表达和敲低都没有对USP22控制的细胞增殖、活力或集落形成具有任何显着的促进或抑制作用。因此，USP22介导的癌细胞体外生长不需要CD274。作者分析了TCGA的癌症研究中 68,054份样本中USP22和CD274在临床癌症病例中的相关性，发现USP22和CD274具有频繁的基因改变和显着的发生趋势。USP22仅在肝HCC（LIHC）和胆管癌（CHOL）中高表达。这些数据表明肝癌是研究体内USP22-CD274调节的理想模型。

        为了探索USP22在有无功能性免疫系统的情况下对肿瘤生长的影响以及对免疫检查点阻断和常规化疗的反应，作者利用WT和USP22 KO H22小鼠肝癌细胞系。作者观察到，在严重免疫缺陷的NCG小鼠中，USP22 KO细胞衍生的肿瘤生长与WT对照细胞非常相似。相比之下，作者发现USP22 KO在很大程度上限制了免疫活性C57BL/6小鼠的肿瘤生长，这表明USP22在肿瘤免疫逃避中起着关键作用。为了进一步评估USP22抑制的免疫原性，分别皮下注射配对的WT和USP22 KO细胞。进入相同免疫活性C57BL/6小鼠的相对侧。结果显示WT肿瘤的生长类似于USP22 KO肿瘤。由于USP22是CD274的DUB，其消耗诱导的CD274不稳定可能会改善CD274靶向免疫疗法。正如预期的那样，与WT肿瘤相比，抗CD274抗体在USP22 KO肿瘤中的治疗效率显着提高，表明USP22敲除促进了抗肿瘤免疫反应。为了研究USP22缺失和常规化疗之间的协同作用，用顺铂(CDDP)治疗携带WT和USP22 KO肿瘤的C57BL/6小鼠。与WT肿瘤相比，USP22敲除提高了CDDP的治疗效果。CD274 KO H22细胞中USP22的敲除仍然能够抑制免疫活性小鼠的肿瘤生长，这意味着不能完全忽略USP22的CD274独立作用。

研究结论：USP22敲除可以增强抗癌免疫。

3.USP22-CD274轴控制TIL和癌症预后     

        由于CD274对TIL有很大影响，而TIL对癌症免疫疗法的功效至关重要，作者在肿瘤模型中测试了CD274表达以及TIL的绝对数量和功能。正如预期的那样，在NCG小鼠、C57BL/6小鼠、与USP22 KO和WT肿瘤共同接种的C57BL/6小鼠、CD274靶向免疫治疗期间或基于CDDP的化疗期间，来自USP22 KO H22细胞的肿瘤中CD274表达水平明显下调。

        在单独接种的小鼠、与USP22 KO和WT肿瘤共同接种的小鼠、免疫治疗期间或化疗期间，CD3t TILs的绝对数量和CD8t颗粒酶B（GZMB）t细胞在CD3t TILs中的相对比例都大大增加。

        为了确定 USP22 是否可能是肝癌的预后标志物，作者进行了Kaplan–Meier生存分析，发现 USP22 的高表达与肝癌患者较差的总生存期 (OS) 相关，以及是否接受索拉非尼治疗有关。USP22的生存相关性与肝炎病毒感染或饮酒无关。为了进一步证实USP22在人类样本中CD274调节中的作用，作者测试了这两种基因在HCC中的表达。在蛋白质水平上，USP22的表达与CD274的表达密切相关。有趣的是，使用内部HCC cDNA库，USP22和CD274在mRNA水平上的表达之间存在正相关。

研究结论：揭示了USP22、CD274和癌症免疫之间的新联系。

结论与讨论

        作者提出了一个工作模型来总结其发现。CD274的翻译后修饰(PTM)被假设是一种抵抗免疫检查点阻断的机制。CD274受多种翻译后修饰的调控，例如泛素化、磷酸化、糖基化和棕榈酰化。CD274 PTM靶向策略在激活抗肿瘤免疫方面取得了重要进展，尤其是通过靶向糖基化CD274。在这项研究中，作者专注于CD274去泛素化的控制，这被认为是维持其蛋白质稳定性和抑制功能的保护机制。作者确定USP22是一种新型的CD274去泛素化酶，并强调靶向USP22在肝癌治疗尤其是在挽救免疫失活方面的重要性。

Thank you!

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31399419/