同源重组介导的双链断裂修复（3）

      Rad51纤丝组装完成并侵入供体链合成新DNA片段后，细胞要将两条缠绕在一起的DNA分离，因为它们属于两条不同的DNA 双链（当然有可能以自身较远处的同源区作为模板，但是这样不分离的话也会导致DNA扭成一团）。此时细胞有诸多不同的选择来应对这一局面，下面我将分情况讨论。

      首先，如果仅仅是双链断裂的一端被capture end，即入侵供体链并合成新DNA，这种特殊的通路被称为break-induced replication (BIR)，常见于另一个双链断裂末端无法被capture的情况（比如有二级结构或者是DNA复制过程中母链突然断裂，那么新生的DNA双链只会有一个末端）。如下图1所示（Li et.al, 2019），其中的断裂末端同时包含二级结构和DNA复制过程中母链断裂，会造成的只有一个双链末端的情况，需要经由BIR通路进行修复。此条通路又是另外一个方向的题目，此处不仔细论述，有机会后期科单独开几期讲述。

（1）

      Synthesis-dependent strand annealing（SDSA），此条通路虽然有second end capture，但似乎并不与首次同时发生，而是已新合成的DNA链作为模板，即在锻炼末端的第二条链开始合成之前供体链已经和断裂末端分离。如下图2所示（Wright et.al，2018），在首次断裂末端侵入供体链并合成了一段DNA后（虚线部分），DNA合成被打断，延伸的DNA从模板链上脱离并重新与另一个断裂末端结合。此时的双链断裂已经被转化为了同一条DNA双链上的两个不同区域的单链断裂，然后断裂链各自以对方为模板合成新DNA链，从而将缺失的部分补全。在破坏最初的异质双链（heteroduplex，指双链DNA中的单链来源于不同的DNA双链，就像是两条DNA双链各自交换了一半）的过程中，最重要的是一种名为Srs2的DNA 解旋酶。它拥有特异性针对Rad51纤丝进行解构的能力，而不会影响DSB修复初期RPA与ssDNA结合形成的复合物。在果蝇当中，Srs2的功能可由BLM（Sgs1）来执行。值得注意的是在SDSA中，合成的DNA并不是像普通的复制过程为半保留（semiconservative）复制，而是保留性复制。

（2）

      在第一个末端end capture发生后，如果另一个末端也经历了end capture(如下图3所示Kramara et.al, 2018)，那么此时所走的通路便是最为人熟知的HR通路（不知道为啥，记忆里第一次接触这个方向便是这个，不知道其他孩纸们是不是这样的）。当两个末端均完成DNA合成后，此时的供体链与修复链之间形成了名为double Holliday Junction（dHJ）的结构，即两条DNA双链之间各自交换了一段单链。为了将这一结构解除，细胞又有几种不同的选择。

首先，第一个蹦出的想法是如果让两个交叉结构向彼此相向移动，那两条DNA链是不是自然就会在双×相遇的时候分离了呢？想法是好的，简单的总是让人感觉舒适，但是他们真的会乖乖的分开吗？的确细胞中存在这样的解旋酶，比如之前提到过的BLM(Sgs1)，但是移动到最后会产生一个关键的问题，那就是中间的DNA链可能会像两只环一样和对方套在一起。这个时候需要短暂性的将其中一条DNA切断，绕过另一条链，然后重新连接，这便是拓扑异构酶（topoisomerase）Top3及其辅助因子Rmi1的功能。在真实的细胞环境当中，为了高效的完成这项任务，解旋酶Sgs1通常会与Top3和Rmi1结合形成蛋白复合物来行使功能。

（3）

除开迁移D-loop的方法之外，细胞还有一种更加快速而方便的方法，即快刀斩乱麻般的直接在每个HJ处切断DNA并重新连接，细胞中行使这个功能的是核酸内切酶Mus81-Mms4复合物。如下图4（Jasin and Rothstein, 2013）所示，通过在每个交叉处引入缺口，交缠在一起的DNA便能如抽丝剥茧一样从另一条链上解离。当然图示的只是一种切割方式，事实上还有另一种切割方式，会导致不一样的修复产物。为了方便理解我为什么说还有另一种切割方式，我们首先需要换个角度观察HJ这个特殊的结构。如下图5（from wikipedia）所示，HJ实际上是由四条DNA链与隔壁链两两配对在一起所形成的，那么以对角线为准的切割方式就有两种（此处推测应为对角线上的两条DNA成对切割，否则连接产物会变得非常乱）。后经考证，MUS81-EME1介导的切割的确是成对线存在的，参考文献：Michael N. Boddy et al. (2001). Cell（这文章的第一作者明明是我的一个轮转导师，为什么我之前没看过这篇文章啊0.0）。一个HJ会有两种切割方式，两个HJ则会有四种不同的组合，但由于对称性，最后的结果只会有两种。为了方便理解，我将dHJ结构中的每一个片段都进行了编号，如图6（original）所示，同时在中间或者同时在上下的剪切会产生同样的结果，而一边在中间另一边在上下也会导致同样的产物（这里的中间上下只是为了方便理解而简化了的图中的切点位置）。对于两条产物中的两条链而言，若彼此没有交换两端的部分（中间链的交换不能视为交换，因为它们是同源的序列相同，所以即使交换了也没有序列上的改变），则称为non-crossover，图6上半部分；对于下半部分而言，存在着序列交换，也就是相当于发生了一次重组，即crossover。这个概念其实刚开始我也纠结了很久，后来自己弄明白之后才发现很多文章里画的模式图都非常有误导性。总之，non-crossover或者crossover都是基于是否发生了序列交换的概念，记住这一点应该就能对不同通路的产物归属于哪一类有个很清晰的理解了。其实关于这个crossover和non-crossover的概念，还有一个与之很相关的过程，即如何利用dHJ消解过程将质粒插入到基因组中的特定位置，以后有空的话会讲一讲这个话题。

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到这里，HR介导的双链断裂修复过程就介绍的差不多了。图7（Wright et.al，2018）是对以上介绍的通路的一个基本总结，实际情况要比这个复杂的多，可以说其中的每一个箭头所代表的过程都凝聚了几个科学家一生的心血。当然这些模型当中也存在一些亟待解答的问题，比如Sgs1-Top3-Rmi1复合物如何确定自己是在朝这正确的方向移动（要是反方向跑估计细胞就会gg），dHJ切割过程中是否成对存在等，HR这一过程仍待进一步的研究。

（7）