2023.7.14华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第五节课程要点

当进行基因克隆时，必须确保被克隆的基因与载体中已有的基因序列“in frame”，否则可能会导致读框移位，最终破坏蛋白质的翻译。关于如何在载体中插入标签的问题。有些载体中已经包含了标签，但有些却没有，因此需要手动添加。在PCR扩增时，只需要更改引物序列，加入标签的编码即可。需要注意的是，在引物中也必须包含起始密码子ATG，否则会导致克隆失败。讨论了两种给质粒添加标签的方法。第一种方法是在PCR引物中添加标签，但只适用于小标签。第二种方法称为SLIM（Site Directed Ligase Independent Mutagenesis），它允许在克隆后向质粒中添加标签。在SLIM中，你设计四个引物并在质粒周围进行PCR。然后，你加热和降温PCR产物，它们混合并环化形成带有标签的质粒。在转化到大肠杆菌之前，你用DPN1消化PCR模板以去除原来的质粒。文本还解释了PCR反应所需的试剂，使用高保真聚合酶的重要性以及DPN1在去除原始质粒中的作用。最后，它还讨论了甲基化在质粒中的重要性以及DPN1仅切割甲基化的模板。

介绍两种基因操作技术：SLIM和site-directed mutagenesis。SLIM 可以用来向DNA中插入小标签或者进行小型或大型的缺失操作，而 site-directed mutagenesis 则可以用来进行点突变操作。对于 SLIM 操作，需要先设计反向互补引物，然后按照一定的步骤进行PCR反应，最后将标签插入到DNA中。而进行 site-directed mutagenesis 操作时，需要先将目标DNA序列翻译为蛋白质序列，然后找到要进行点突变的位点，接着设计特定的引物，在PCR反应中加入DPN1消化酶，最后转化到目标细胞中筛选出突变体。这两种技术都需要使用一定的基因学知识，但都能较容易地实现DNA操作，达到所需目的。

讲述了如何在微生物中进行基因突变的步骤。首先，需要克隆想要突变的基因，并使用限制性酶进行克隆。其次，使用定向突变技术在质粒中进行突变，生成突变体。最后，使用同源重组技术将新基因插入到细胞中。还介绍了为什么需要进行基因突变。通过两个案例，阐述了如何使用基因突变技术来探究蛋白质相互作用和功能。第一个案例是如何探究蛋白质相互作用。作者介绍了一个研究aphids（蚜虫）胃液中的蛋白质与植物蛋白质相互作用的实验。作者使用基因突变技术在植物蛋白质中引入不同的突变体，然后在柱子上进行pull down实验，找到了蛋白质相互作用的位点。第二个案例是如何探究蛋白质的功能。作者介绍了Syd B蛋白的实验。Syd B蛋白可以使精子不育。作者使用基因突变技术在Syd B蛋白中引入不同的突变体，通过比较各个突变体的精子育性，找到了引起不育的蛋白质结构域。

讲述了三个使用定点突变技术的例子。第一个例子是研究Sid B基因和其产物对生殖细胞质量的影响，通过将野生型和突变型Sid B基因转入果蝇中，证明了一个特定的氨基酸残基（C 1025）控制了果蝇的生殖能力。第二个例子是使用突变技术改进biotechnology工具——tn5转座子，使其具有更高的活性，以方便将目标基因插入到细菌染色体中。第三个例子是突变技术在限制性内切酶克隆中的局限性，长序列的基因很难进行限制性内切酶克隆，因为很容易在基因内部找到内部限制酶位点。限制性内切酶克隆适用于短基因，但不适用于长基因。除此之外，英文中还提到了限制性内切酶克隆的另一个局限性，即难以同时克隆两个目标基因，因为需要找到两个不同的限制酶位点。

讨论了克隆中的限制酶克隆的问题和Gibson克隆的优点。

限制酶克隆的局限性在于，克隆后留下的疤痕可能会损坏蛋白质，这可能会在构建复杂的构建物时需要进行多个克隆步骤。相反，Gibson克隆是一种无疤痕克隆方法，可以同时克隆多个DNA片段，从而避免了这些问题。Gibson克隆的过程包括PCR扩增每个组件，设计PCR引物以生成重叠的序列，使用t5外切核酸酶切除重叠部分并组装DNA片段。与限制酶克隆相比，Gibson克隆的优点是可以同时克隆多个片段，并且不会留下疤痕。

介绍了PCR技术中的一种叫做“sewing PCR”或“overlap extension PCR”的技术，它类似于Gibson assembly，但不使用t5exo核酸。在sewing PCR中，设计引物的方式与普通PCR相同，但需要进行三个PCR反应，并在第二个PCR反应中使用第一个PCR反应生成的产物作为引物。然后，将DNA聚合酶加入管中，使其进行扩增，从而将不同的DNA片段缝合在一起。然而，与Gibson assembly和overlap extension PCR相比，使用sewing PCR的引物更容易形成发夹结构，导致反应失败。

此外，还讨论了slim和sight directed mutagenesis在大质粒中进行的困难，并提出了将目标基因亚克隆到较小质粒中的解决方案。这需要使用限制性内切酶切割目标基因，并将其连接到较小的质粒中，然后进行突变并验证，最后再将突变后的基因亚克隆回目标质粒中。为了使亚克隆有效，需要使用相同的限制性内切酶位点。

最后，还介绍了适用于slim和sight directed mutagenesis的PCR程序，其中包括98°C的初始变性步骤、85°C的热启动步骤以及循环中的98°C的变性步骤、56°C的退火步骤和72°C的延伸步骤。在延伸步骤中，延伸时间取决于模板的大小和使用的高保真聚合酶的扩增速率。

讲述了一个关于微生物基因组最小必需基因的研究，以及如何识别这些基因的方法。在研究中，科学家们使用了一些实验策略，例如构建突变体库、测序RNA、在线查阅已知基因等方法，以确定细菌中的最小必需基因。但是，由于基因的本质，突变可能会导致基因失活，使得一些实验策略难以得到有效结果。因此，这项研究需要耗费大量时间和精力。最终，确定了最小必需基因的答案，这有助于我们更好地理解微生物的构建和生存方式。

讲述了一项关于微浆膜最小基因组的研究。研究团队使用了两种策略来确定微浆膜细胞中哪些基因是必需的。首先，他们使用比较基因组学的方法，比较了不同微浆膜物种的基因组，找到了它们之间的共同基因作为基因组中最小必需基因的假设。接着，他们使用转座子插入的策略，选择那些没有转座子插入的基因作为必需基因。最后，他们使用Gibson PCR组装技术，将这些基因组装成了一个完整的最小基因组，从而证明了哪些基因是必需的。这项研究对于了解微浆膜生物学以及合成生物学的发展具有重要意义。

讲述了合成生物学中的两个重要技术：Gibson装配和重组技术。Gibson装配是一种将DNA序列组装成更大的DNA分子的方法，它通过PCR扩增和连接DNA片段来实现。重组技术则利用重组酶将DNA序列进行重组和重定向，以产生新的DNA序列。文章还介绍了Lambda噬菌体的生命周期和基因组结构，并讨论了在重组过程中使用的三种重要蛋白质：beta、exo和gamma。这些蛋白质可以增强重组的效率，提高DNA插入的成功率。这些技术对于合成生物学的研究和应用具有重要意义。

讲了lambda噬菌体的基因组如何通过三种蛋白质（beta、EXO和gamma）来提高大肠杆菌中线性DNA的重组效率，从而构建大片段的DNA序列。这些蛋白质可以保护线性DNA免受大肠杆菌内切酶的降解。该过程可以通过热激活lambda启动子来诱导。使用此过程可以构建比限制性内切酶更大的DNA片段，这些片段可以通过重组技术逐渐拼接。与Gibson组装不同，重组使用重组技术将大片段DNA插入到染色体中。