Dr.Zou经验分享 | 单细胞测序中临床肿瘤样本的前处理

邹博士本期的经验分享将和大家聊一下在单细胞测序中临床肿瘤样本前处理的注意事项。对于临床肿瘤样本前处理的重要性和难度，相信所有做过单细胞测序研究的老师都深有体会。总结前处理的各个细节，归纳起来包括影响样本两个属性：

一是生物代表性，二是细胞活性。

生物代表性通俗的说就是细胞成分对不对，用于做单细胞测序的细胞悬液，还是不是能代表最初在患者体内的那块肿瘤组织。

细胞活性通俗的说就是细胞状态好不好，能否拿到足够数目的高活性的单细胞悬液，用于最终的检测。

生物代表性和细胞活性，可以说是一个单细胞研究项目最基础最重要的要素之一。它直接决定了整个单细胞项目的数据质量（稳定性、检测灵敏性，组间差异程度等等）。

下面我们从样本获取阶段，单细胞悬液制备阶段，悬液后处理阶段三个阶段细分，给大家分享下我们中科普瑞单细胞研究平台在这方面的经验：

一、临床肿瘤样本获取阶段

我们都知道临床肿瘤样本具有高度的异质性，来自不同人的同一类肿瘤的样本，甚至是同一块肿瘤组织的不同位置，它的细胞组成和基因表达谱都差异非常大。所以从临床肿瘤样本的获取阶段，就要开始注意各种小的细节。通常的做法是对于实体肿瘤组织，随机取其中的一小块，对其进行检测。实际上根据我们的经验，我们更推荐对于同一块肿瘤组织，多点取样，多点分别检测，可以更有效的覆盖整个组织的细胞成分异质性。而如果因为一些限制因素，一个肿瘤组织只能取一个样本，那就选择取一个横截面的片状组织，可以更好地展现组织的细胞组成和基因表达谱的异质性。

同样，临床肿瘤样本的获取阶段，也有一些细节，有助于维持细胞的活性。

我们总结了下包括四个要点：干净、鲜活、流程、快速

²  干净。比如要尽可能地用生理盐水去除组织表面的血渍、液体、筋膜等杂质，否则可能会对酶解或后续其他步骤有影响。

²  鲜活。避免取到存在大量凋亡细胞的组织，例如切割的边缘造成的焦黑组织。实体瘤核心区域往往因为缺少氧气和养分而存在一定比例的细胞凋亡，也应避免取到这一部分。否则注定了最后组织解离得到的细胞悬液活性不高。

²  流程。对于手术中常规的一些操作，参考临床客户的一些经验，也有一些可以注意的细节：比如针对要手术的组织器官，为了防止出血过多，首先是要暂停几条主要的血供，这个过程可能就半小时过去了；在缺少血供的情况下再进行下一步的手术，最后才能在组织上取一块作为待检测样品，组织器官已经缺血缺氧一段时间了，很可能细胞活性已经受到了影响，是否可以考虑在操作规程允许的情况下，在断血供尽量短的时间内，取到样品。还有例如手术过程中会频繁涉及到所有事物的消毒（无论是擦拭或浸泡），都应该避免对检测物品做消毒处理。

²  快速。手术过程中取得了样品后，需要尽快放置到冰上低温保存，并且尽快进行运输和后续酶解操作。

二、单细胞悬液制备阶段

在单细胞悬液制备阶段核心原则就是“质与量的取舍”。

Ø  “质”就是细胞活性。解离时间越短，步骤越简单，细胞活性往往越好，但细胞数可能不够多。

Ø  “量”就是细胞数目。解离时间越长，过程越复杂，往往细胞得率越高，但是往往细胞活性会随时间下降。

Ø  “取舍”就是找到一个平衡点，一个合适的时间窗口，能保证解离出足够的细胞数，同时也不至于是细胞活性下降太多。常见时间是在30-60min不等。

另外不同的消化酶的底物不同，活性强弱也不同，所以常常针对不同种的临床样本，做酶解配方的选择和酶解条件的调整。

以上这些酶解条件，推荐大家可以参考已发表的文献，或者跟我们中科普瑞的技术人员沟通，获得一些初步的经验。

此外，在单细胞悬液制备阶段，有一些细胞比较特殊。比如一些细胞特别敏感，很容易在组织解离过程中死亡的细胞。或者细胞形态特殊，不能正常进行单细胞捕获的细胞。例如神经元细胞，生殖相关细胞，心肌细胞，脂肪细胞等等。针对这一些细胞，慢慢又发展出了提取细胞核，做单细胞核测序的实验方法。

单细胞核测序与单细胞测序各有优缺点，目前应用最广泛的仍然单细胞测序，以下我们也总结了单细胞核测序的优势和劣势，供大家参考：

单细胞核测序的优势：只需要常规的速冻保存操作，理论上细胞的状态冻结在那一瞬间，避免了在运输保存以及酶解过程中带来的转录组应激改变。并且细胞核普遍在10μm上下，对于神经元细胞，卵母细胞，心肌细胞等特殊细胞类型的捕获，不受形态、大小限制。

单细胞核测序的劣势：转录本数目减少，丢失了细胞浆的大量mRNA转录本。核内并且大部分是不成熟的mRNA，带有大量Intron，提高了定量分析的难度。并且单细胞核测序不利于免疫细胞的捕获。

所以，要根据实际的情况（比如研究目的、样本的状态）做取舍，选择使用单细胞测序还是单细胞核测序。

比如常规单细胞测序检测神经组织的结果，往往免疫细胞，血管内皮细胞，基质细胞等占多数，神经元几乎检测不到。而如果改用单细胞核测序，那可能检测结果中90%以上是神经元细胞核，其他细胞类型大大减少。所以就要根据您的研究目的来决定到底用单细胞测序还是单细胞核测序。

三、悬液后处理阶段

在悬液后处理阶段，这包括我们大家都比较熟悉的一些实验方法和步骤，例如流式或磁珠分选，红细胞裂解，死细胞去除等等。

这些方法都是针对细胞悬液做的一些后处理，以使其满足我们的研究目的和单细胞测序的质控要求。但这些后处理操作往往也是双刃剑。

后处理的优势：对感兴趣的目的细胞起到了富集作用，并排除了不想要的细胞（红细胞、死细胞等等），同时也去除了细胞悬液中的碎片，杂质。

后处理的劣势：失去了细胞悬液原本的细胞类型的比例信息。同时增加了额外步骤，延长了操作时间，可能造成细胞活性的进一步下降。

我们建议您要根据实际的情况（比如研究目的、样本的状态）做取舍。

²  如果只想研究某一种特定的细胞类型，并且它的比例在初始细胞悬液中的比例非常低（不超过5%），那肯定要通过后处理，富集到希望研究的细胞类型。

²  如果除了想研究的特定细胞类型，但也希望不丢掉其他细胞类型的特征信息，以及微环境的细胞通讯网络等信息，那要么不做后处理，保留所有细胞，要么做完后处理，同时保留两个组分的细胞（比如CD45阴选，除了检测非免疫细胞之外，免疫细胞不扔掉，也平行做检测，最后分析时放在一起分析，这样既能研究目的细胞，又能兼顾其他细胞）。

BD-中科普瑞单细胞研究联合实验室经过多年的技术积累，已完成样本数千例，协助客户发表SCI论文数十篇，拥有丰富的样本前处理和单细胞测序技术经验，如果大家有任何问题，欢迎您随时联系我们来帮助您解决单细胞测序研究中的各种技术问题！

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