表达谱芯片的制备

1992年，Stephen Fodor博士建立了Affymetrix公司；

Affymetrix公司在基因芯片领域具有很高的地位，以“原位光刻合成技术”的基因表达谱芯片最著名；

它的表达谱芯片分为传统的in vitro transcription (IVT)芯片和新一代的whole transcription (WT)芯片；

在GEO数据库中收录的大多数表达谱芯片都是Affymetrix公司；

在GEO数据库中，我们能够看到每个芯片ID对应的gene symbol，以及代表基因表达量的数值，但更深入的原理知之甚少，所以今天就简单和大家介绍一下Affymetrix的IVT芯片；

可以将芯片理解成一张精密的玻璃板，术语叫晶片Wafer, 晶片泡入硅烷后，就沾有硅烷，再铺上一层带有光敏阻断分子的接头分子，这个光敏阻断分子特别的重要，当紫外照射后，光敏阻断分子就会掉落，碱基基团得以暴露，就可以连接下一个碱基，这里加的所有碱基也是带着光敏阻断分子的，我们可以想象一下，一张晶片，假设有十万个接头分子，其中1万个接头分子的下一个碱基是腺嘌呤，那么我们只需要用一张挡板盖住剩余9万个接头分子，用紫外照射那一万个接头分子，光敏阻断分子脱落，然后加带有光敏阻断分子的腺嘌呤，再加入封帽基团，封帽基团结合没有光敏阻断分子的孔，防止刚刚碱基没加上的，导致序列错误；

随后，逐个通过紫外照射--加碱基--封帽基团--紫外照射--加碱基--封帽基团；

Affymetrix的IVT，每个序列25个碱基，也叫DNA探针；

至此，芯片制作完毕；

然后就是待测样品制备：

total RNA因为具有polyA尾巴，所以先用oligdT引物将mRNA反转+复制为cDNA，因为cRNA与DNA探针结合更紧密，所以这里的cDNA转录为带有生物素标记的cRNA，cRNA经过片段化，与刚刚做好的芯片结合，通过加入藻红蛋白链酶亲和素，扫描每个feature的荧光强度即可知道每个ID的表达量；

前面我们提到的玻璃晶片内部是一个个feature,每个feature代表一个基因的一个探针，一个基于会设计多个探针，由于是采用polyA反转的方法，所以探针设计也都是RNA的3'端，这也具有很大局限性，因为有些基因会经过可变剪切，3‘IVT只是设计在基因的3’端，忽略了其它exon；

因此，把其它exon也考虑进去的WT芯片应运而生，在所有exon，甚至exon-intron之间设计了探针；

我们在GEO分析转录组时候常常遇到一个ID对应的gene symbol有多个基因名，为什么呢？

因为多个基因的3‘端序列一样，就导致了一个ID对应多个基因，遇到这种ID就只能排除，这也是WT芯片的优势，可以通过在其它exon区设计探针，区分开每个基因；

四不四又掌握了一个知识点呢~

可以和身边的人普及表达谱芯片喽~

注意今天讲的是Affymetrix家的3‘IVT芯片

其他家的芯片知识也会陆续放送，敬请期待吧~

2016年3月，Affymetrix被赛默飞收购……