四川农业大学运用TMT磷酸化蛋白质组学探究玉米调控耐旱性机制
前言
玉米是最重要的作物之一，主要用于粮食供应、牲畜饲料和工业。由于易受缺水的影响，其生产力受到干旱压力的严重限制。许多蛋白质将通过蛋白磷酸酶(PPs)催化的去磷酸化而被激活或失活(Cohen，1989)。根据其底物特异性，PPs主要分为三个家族，即丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)特异性磷酸化蛋白磷酸酶(PPP)、金属依赖蛋白磷酸酶(PPM)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。PPP和PPM家族编码丝氨酸/苏氨酸 PP，而PTP家族包括酪氨酸特异性和双特异性磷酸酶。PP2C的A亚类成员作为脱落酸(ABA)的共受体，与ABA受体蛋白PYR/PYL/PCAR和SNF1相关蛋白激酶2s(SnRK2s)负调控ABA信号，并在植物生长、发育和刺激反应中发挥重要作用。
2022年4月，四川农业大学付凤玲/于好强教授课题组在《Frontiers in Plant Science》期刊发表了题为的研究成果，运用磷酸化蛋白质组学研究发现了一个新的B亚类成员，命名为，并分析其活性、定位和相互作用的蛋白。通过转基因拟南芥和水稻表型以及玉米突变体确定了其在耐旱性方面的功能。数据表明，通过去磷酸化ZmMAPK3/ZmMAPK7和损害玉米的光合作用来负调控抗旱性。
中文标题：ZmPP2C26选择性剪接变异负调控玉米的抗旱性
发表期刊：Frontiers in Plant Science
影响因子：6.627
作者单位：四川农业大学
运用生物学技术：磷酸化蛋白质组学（由欧易/鹿明生物提供技术支持）
研究背景
在拟南芥中，PP2C的6个B分支B成员中的3个，包括AP2C1、AP2C3和PP2C5，它们在气孔发育、免疫、防御和K+缺陷反应中的功能得到了阐明。烟草B亚类成员NtPP2C2b被发现可以调节尼古丁的生物合成。然而，PP2C的B亚类成员在作物中的功能尚不清楚。
研究思路
（点击查看大图）
实验方法
研究材料：耐旱玉米自交系81565/87-1、干旱自交系200B/DAN340
1.磷酸酶活性测定
2.酵母双杂交，双分子荧光互补，和GST Pull-Down
3.亚细胞定位和共定位
4.磷酸化试验
5.转基因拟南芥、水稻和玉米突变体的表型分析
6.TMT标记定量磷酸化蛋白质组学研究
研究结果
1、第一外显子产生的两个突变类型
在基因克隆过程中，作者利用一对引物扩增了两个AS变体，定义为和 (图1A)。序列比对结果显示，与相比，的第一个外显子保留了213 bp。剪接位点为5’CC……GC-3’，既不是U2型，也不是U12型，而是一种新的AS类型AFE （可变的第一个外显子）(图1B)。蛋白质序列比对显示，被保留的71 aa具有高度保守的MAPK相互作用基序KIM Motif (图1C)，这意味着可能与一些ZmMAPK成员相互作用。
图1 |通过AFE型的剪接变体
2、剪接变异体与ZmMAPK3和ZmMAPK7相互作用
为了探讨/是否参与了ABA和MAPK信号转导，作者采用Y2H实验测定了它们与13个ZmPYLs和20个ZmMAPKs的相互作用。结果显示，/与13个ZmPYLs均无相互作用。然而，在X-α-Gal的四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade/)SD板上，AD-ZmPP2C26L和BD-ZmMAPK3/BD-ZmMAPK7、ADZmPP2C26S和BD-ZmMAPK3共转化的酵母菌株以及阳性对照(即AD-T和BD-53) 可以生长良好并染成蓝色 (图2A）。
GST Pull-down结果显示，His-ZmPP2C26L被GST-ZmMAPK3/-ZmMAPK7拉下，而His-ZmPP2C26S仅被GST-ZmMAPK3拉下(图2B)。BiFC实验进一步表明，nYFP-ZmPP2C26L和cYFP-ZmMAPK3/cYFP-ZmMAPK3/cYFP-ZmMAPK7共表达以及nYFP-ZmPP-ZmPP2C26S和cYFP-ZmMAPK3共表达可以产生较强的YFP荧光信号(图2C)。
这些结果证实了与ZmMAPK3和ZmMAPK7发生相互作用，而仅在体内外与ZmMAPK3相互作用。
图2 | /与ZmMAPK3/ZmMAPK7的相互作用
3、ZmPP2C26去磷酸化ZmMAPK3和ZmMAPK7
为了检测/是否去磷酸化ZmMAPK3/ZmMAPK7，作者在体外进行了去磷酸化实验。如图3所示，在Phos-TagTM SDS-PAGE凝胶上没有或的情况下，仅能检测到磷酸化ZmMAPK3/-ZmMAPK7。然而，当HA-ZmMAPK3/HA-ZmMAPK7与His-ZmPP2C26L孵育，HA-ZmMAPK3与His-ZmPP2C26S孵育时，检测到去磷酸化的ZmMAPK3/ZmMAPK7。
值得注意的是，随着浓度的增加，磷酸化的ZmMAPK3/phoshoZmMAPK7蛋白的表达量降低。
图3 | 体外去磷酸化实验
4、ZmPP2C26L/ZmPP2C26S的亚细胞定位
为了确定的亚细胞定位，将其ORF在35S启动子的控制下与eGFP融合，在本式烟草叶片中瞬时表达。共聚焦激光扫描显微镜显示，ZmPP2C26L-eGFP在叶绿体和细胞核中被检测到荧光信号，而ZmPP2C26L-eGFP在细胞质和细胞核中被检测到荧光信号 (图4A)。
共定位也显示与在细胞核中共定位，与共定位于细胞质和细胞核(图4B)。这些结果表明 和 的功能可能有所不同。
图4 | 亚细胞定位和共定位
5、和负调控耐旱性
如图5所示，在干旱胁迫2周后，转基因株系的干旱敏感性增强，而野生型幼苗则出现了轻微的枯萎病。L1、L2、S1和S2两株系的存活率分别为44.5、54.3、5.2和6.0%，均显著低于WT（90.8%）。在干旱胁迫条件下，转基因株系的根长明显短于野生型。在最佳条件下，L1和L2株系的叶绿素含量和光合速率均显著低于WT。S1和S2品系与WT相比无显著性差异。
如图6所示，的Mu转座子插入导致RT-PCR鉴定的被敲除。与野生型相比，具有耐旱表型。干旱胁迫后，的存活率为87.5%，而野生型仅为12.5%。的根长和根干重也显著高于WT。突变体的叶绿素含量和光合速率均显著高于WT。
以上结果表明，负调控抗旱性，且变异对干旱的敏感性高于。
图5 | 干旱胁迫下转基因水稻株系的表型分析
图6 | 干旱胁迫下玉米的表型分析
6、改变蛋白磷酸化水平
KEGG富集途径分析显示，影响的磷酸化蛋白主要富集于光合作用中，而影响的磷酸化蛋白与光合作用和丙酮酸代谢中的碳固定有关（图7）。
图7 | 转基因水稻的磷酸化蛋白质组学鉴定了一组受影响的磷酸化蛋白
在中，分别有324个和347个磷酸化蛋白表达上调和下调。由于是一种PP，因此在植株中，由于其靶点的磷酸化水平应该有所提高。KEGG通路分析表明，上调的磷酸化蛋白在多种途径中富集，但主要参与光合作用（图8）。
图8 | 突变体的|磷酸化蛋白质组学鉴定出受影响的磷酸化蛋白
图9 | 描述选择性剪接变异负调控耐旱性
研究结论
作者鉴定了一个B型2CPP分支，即，其通过非典型的AS，可产生了两个亚型。
直接使ZmMAPK3和ZmMAPK7去磷酸化，从而负调控干旱胁迫和光合作用活性。
小鹿推荐
本研究为了揭示对蛋白磷酸化的整体影响，利用基于TMT的定量磷酸化蛋白质组学分析过表达株系，探索胁迫相关基因将有助于促进分子设计育种，提高玉米的抗旱性，为PP2C响应非生物胁迫的机制提供了新的见解。
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