盘点常用的分子互作实验！

2023-09-22 14:01 作者:南京福麦斯生物 0人读过 | 我要投稿

在探索不同分子机制的时候，需要用到不同的实验技术方法对实验目的进行反复论证。

目前高分杂志对于文章的创新性和机制深度的要求越来越高，除了经典的qPCR和WesternBlot方法外，新的技术越来越多的被应用到各类相关文章中！今天盘点下“直接机制”中的分子互作实验！

分子间互作实验的类型

根据作用的分子类型（DNA、RNA和蛋白），可以将分子间互作分为以下：

①蛋白质-蛋白质：如免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀(CO-IP)、GST pull-down、Far-Western Blotting

②蛋白质-RNA：如RIP、RNA pull down

③蛋白质-DNA：如染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

④蛋白质-DNA/RNA：如凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

⑤RNA-DNA：如荧光素酶实验（Luciferase Assay）

一、蛋白质-蛋白质

1.免疫沉淀（IP）

免疫沉淀IP 是利用抗体特异性反应富集纯化目的蛋白的一种方法，可用于目的蛋白的定性和定量分析。是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一。

免疫沉淀（IP）的原理为：

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G”特异性的结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。

实验步骤：

针对特定靶蛋白的抗体与样品（细胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫复合物，随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。

2.免疫共沉淀(CO-IP)

Co-IP是免疫沉淀（IP）的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。是一种以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究体内(in vivo)蛋白质相互作用的经典方法，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。

Co-IP的原理：

基于IP反应捕获和纯化靶蛋白，如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白，也会被一同捕获及纯化得到，随后利用SDS-PAGE、Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析。

免疫共沉淀的优势：

与其它研究方法相比，该体系是在生理条件下检测蛋白质之间的相互作用，因此，不仅可以检测到体内形成的天然复合体，而且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性。其次内源性的靶蛋白质是完全加工、修饰和成熟的蛋白质，因此，依赖于修饰的蛋白质相互作用也能被检测到。

3.GST pull-down

GST-pulldown技术主要用于研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，可以验证两种已知的蛋白质可能存在的直接相互作用或者寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知靶蛋白，且体外验证蛋白直接相互作用时有较强的特异性。

GST pull-down的基本原理：

将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶与之孵育，从而捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot 或质谱分析，从而证实两种蛋白间的相互作用。

补充：co-IP 和GST pull-down区别

①co-IP：研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用，反应的是比较真实的蛋白质相互作用，由于沉淀下来的是蛋白质复合物，不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。

②GST pull down：可以确定目的蛋白和检测蛋白是否发生直接相互作用，但是无法得知体内真实的结合情况。

4.Far-Western Blotting

Far-western blotting 该技术是由 Western blotting 衍生而来研究蛋白质相互作用的方法，是一种体外（in vitro）检测蛋白间相互作用的分子生物学方法。它可以验证已知蛋白间的相互作用，或分析已知蛋白和未知蛋白间的相互作用。由于该方法灵敏度较高，现已得到广泛的应用。

在Westernblot实验中，用特异性抗体（一抗）去检测膜上的蛋白，HRP标记的二抗与一抗结合，通过显影观察膜上的蛋白。而在Farwesternblot中，将靶蛋白固定在PVDF/NC膜上，用诱饵蛋白(已知蛋白）作为探针去检测膜上的靶蛋白，再利用特异性抗体孵育、检测，以此来分析靶蛋白和诱饵蛋白间的相互作用。

Far-westernblot实验流程主要包括：凝胶电泳-转膜-封闭-孵育-检测，如下图所示。

二、蛋白质-RNA

1.RIP

RIP是一种RNA结合蛋白免疫沉淀技术，用于检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用，以蛋白为主角。

RIP的基本原理：

用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip）、定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

2.RNA pull down

RNA pull-down 作为研究 RNA 与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点，是近年来研究IncRNA、circRNA与蛋白质相互作用的主要手段。其以RNA为主角，研究其与蛋白的互作。

RNA pulldown的基本原理：

使用体外转录与生物素标记RNA，然后与细胞或组织的提取液进行孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物与链霉亲和素磁珠结合，通过磁分离与孵育液中的其他成份分离。再利用游离生物素竞争洗脱复合物，通过WB实验检测特定的蛋白是否与RNA相互作用，或者运用质谱筛选RNA结合的未知蛋白。

三、蛋白质-DNA

1.染色质免疫共沉淀(ChIP)

CHIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，CHIP又分为CHIP-qPCR（已知蛋白和靶序列）和CHIP-seq（已知蛋白和未知序列）。CHIP应用于检测与蛋白结合的DNA序列，常用于研究转录因子或组蛋白修饰。并且CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

染色质免疫共沉淀(ChIP)的原理：

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。