USP11作为组蛋白去泛素化酶在DNA修复过程中的染色质重组中发挥作用
写在前面
今天推荐的是由北京大学医学部基础医学院在2019年8月19日发表于Nucleic Acids Research（2020IF：16.971，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Luyang Sun教授，研究表明USP11作为组蛋白去泛素酶在DNA修复过程中发挥染色质重组的作用。
研究背景
真核细胞进化出高效的DNA修复系统，以引导基因组的完整性，进而应对外源性和内源性的DNA损伤。未修复或错误修复的DNA损伤可导致断裂位点的严重染色体重排或突变，最终导致肿瘤发生、炎症性疾病和衰老。如何调节染色质动力学以确保有效的DNA修复仍有待探究。
摘要部分
在这里，作者报告了泛素特异性蛋白酶USP11作为组蛋白去泛素化酶催化H2AK119和H2BK120去泛素化。作者发现USP11与染色质重塑NuRD复合物在物理上相关，并在功能上参与DNA修复过程。作者证明了USP11介导的组蛋白去泛素化和NuRD相关的组蛋白去乙酰化协调，以允许及时终止DNA修复和染色质结构的重组。因此，USP11参与染色质凝聚、基因组稳定性和细胞存活。总之，这些观察结果表明USP11是一种染色质修饰剂，在DNA损伤反应和维持基因组稳定性方面起着至关重要的作用。
研究内容
1.USP11作为组蛋白去泛素化酶催化H2AK119和H2BK120去泛素化
组蛋白修饰如泛素化和随后的DNA修复蛋白募集是响应DNA损伤的调节网络的组成部分，并且许多DUB与DNA修复过程有关。作者使用了81个siRNA库来单独敲低HeLa细胞中的每个相应的DUB。通过成像系统检查细胞中H2BK120ub和53BP1IRIF形成的免疫荧光强度，显示几个DUB的阳性结果。有趣的是，H2BK120ub的平均免疫荧光强度在USP11敲低后显着增加。通过western blot分析获得了类似的结果。同时，对 siDUBs处理的HeLa细胞中53BP1的IRIF形成的分析表明， USP11、USP12、USP14、USP15 或USP37 的敲低都导致53BP1IRIF增加。这些观察结果表明，USP11可能通过靶向H2BK120ub与DDR相关联。
用针对泛素化H2AK15、H2AK119或H2BK120的抗体对酸提取的组蛋白进行western blot分析，组蛋白中的普遍泛素化位点表明USP11敲低导致H2AK119ub 和H2BK120ub 的水平增加，而USP11过表达导致H2BK120和H2AK119的泛素化水平降低。H2AK15ub的水平没有观察到明显的变化。为了支持USP11在功能上与去除H2AK119和H2BK120泛素化有关的观点，作者通过定点诱变创建了一个USP11突变体USP11/C318S。从HEK293T细胞中提取的组蛋白的蛋白质印迹分析显示，野生型USP11的过表达导致H2BK120ub 和H2AK119ub 水平的显着降低，而USP11/C318S 的过表达对H2BK120ub 和H2AK119ub 的水平没有明显影响。此外，用细菌表达的 GST-USP11或 GST-USP11/C318S 和小牛胸腺组蛋白进行的体外去泛素化分析，然后进行蛋白质印迹分析表明，野生型USP11可以以剂量依赖性方式有效地从H2BK120和H2AK119中去除泛素，而非USP11/C318S。
研究结论：USP11通过其去泛素化酶活性催化H2BK120和H2AK119去泛素化。
2.USP11与NuRD复合物发生物理相互作用
作者接下来采用亲和纯化和质谱法在体内探究USP11相互作用物。为此，HEK293T细胞被FLAG标记的USP11稳定转染。含USP11的蛋白质复合物的质谱分析表明，USP11与 MTA2、HDAC2、RbAp46/48、核小体重塑和脱乙酰酶的所有成分共同纯化（NuRD) 复合体。免疫共沉淀 (IP)实验结果也证实了这一点。进一步的 co-IP 实验还证实了USP11与NuRD组件的相互作用。此外，USP11的洗脱模式与包括 Mi-2、MTA2、HDAC1/2、RbAp46/48 和 MBD3 在内的NuRD复合蛋白的洗脱模式在很大程度上重叠。总之，这些结果支持USP11/NuRD复合物在体内的存在。
为了进一步巩固USP11和NuRD复合物之间的相互作用，使用细菌表达的USP11和NuRD复合物进行了 GST 下拉测定。实验表明USP11能够直接与MTA2、HDAC2和MBD3相互作用，但不能与作者测试的NuRD复合物的其他成分相互作用。
研究结论：USP11与NuRD复合物发生物理相互作用。
3.USP11/NuRD复合物在DNA损伤时被募集到DNA断裂位点
作者接下来研究了USP11如何选择NuRD复合物参与DNA损伤反应。为此，作者首先探究了DNA损伤后USP11与NuRD复合物的核重新分布的关系。从用X射线IR预处理的HeLa细胞中提取核蛋白，并将其分成无染色质和染色质结合部分，结果检测到IR触发的H2AX 磷酸化。暴露于IR后，可溶性组分中USP11、MTA2和HDAC2的蛋白质水平降低，而它们在染色质结合组分中的积累增加。在IR暴露后，USP11的蛋白质表达增加，并且USP11/NuRD复合物的募集在HEK293T和U2OS细胞中升高。类似地，用烷基化DNA损伤剂甲磺酸甲酯或DNA链间交联剂丝裂霉素C (MMC) 处理HEK293T细胞导致USP11蛋白稳态水平增加和USP11/NuRD复合物的形成，表明USP11/NuRD复合物在DNA损伤反应中的重要作用。为了进一步证明USP11/NuRD复合物被招募到DSB附近，作者利用DIvA系统，其中用4-羟基他莫昔芬（4OHT）处理会引发AsiSI内切酶的核转位，从而使DSB在人类基因组的AsiSI靶向序列上被诱导。定量ChIP（qChIP）分析显示，与H2AX类似，在稳定表达HA-AsiSI质粒的U2OS细胞中，4OHT诱导的AsiSI激活后，USP11、MTA2和HDAC2在近端断裂点周围富集。如蛋白质印迹所示，AsiSI系统的工作效率通过AsiSI的核定位和响应4OHT的H2AX诱导得到验证。
接下来，对稳定表达 GFP-USP11、GFP-MTA2或 GFP-HDAC2的U2OS细胞进行延时成像分析。USP11、MTA2和HDAC2对激光诱导的DNA损伤的富集在10分钟时观察到，并在紫外激光微照射后30分钟达到峰值。此外，在U2OS细胞中较低剂量的激光微辐照和更长的恢复时间测量表明，USP11、MTA2 和 HDAC2与H2AX共定位并在微辐照后1小时共富集激光诱导的DNA断裂位点。此外，通过免疫荧光显微镜进行的Duolink邻近连接测定 (PLA) 显示USP11、MTA2和HDAC2共定位于激光造成的DNA损伤轨迹。此外，MTA2或HDAC2的敲低导致USP11的募集减少到激光造成的DNA损伤轨迹，并且USP11敲低阻碍了DSB位点中的NuRD富集，表明USP11和NuRD成分对USP11/NuRD重新定位到DNA损伤位点具有协同促进作用。
研究结论：USP11/NuRD复合物在DNA损伤时被招募到DNA断裂位点。
4.DNA损伤反应中组蛋白去泛素化和去乙酰化之间的串扰
为了进一步了解USP11/NuRD复合物在DNA损伤反应中的参与，U2OS细胞在IR后的不同时间点用X射线IR处理组蛋白提取。Western blot分析显示，H2AK119ub和H2BK120ub的水平在IR暴露后1-4小时达到高峰，此后逐渐下降。然而，当USP11被敲低时，H2AK119ub和H2BK120ub的水平在IR处理后的所有时间点都会增加。有趣的是，USP11敲低导致了H3ac水平的增加和H3ac清除的延迟。用MMC处理也得到类似的结果。这些观察结果意味着在DNA损伤反应中组蛋白去泛素化和去乙酰化之间存在串扰。U2OS细胞转染了野生型USP11或去泛素化酶活性缺陷的USP11/C318S突变体，并用DNA损伤试剂喜树碱（CPT）和依托泊苷处理。结果发现USP11的过量表达，而不是USP11/C318S，与响应CPT和VP16处理的H2AK119ub和H2BK120ub的水平降低有关。
为了进一步了解USP11/NuRD复合物在DNA损伤反应期间的染色质参与情况，通过内切酶AsiSI检测和qChIP分析显示，USP11敲低阻碍了MTA2和HDAC2在DSBs中的招募，因此在4OHT处理后不仅阻止了H2AK119ub和H2BK120ub的清除，也阻止了DNA断裂区周围H3ac的清除。类似地，HDAC2的敲低与4OHT处理后DSB中与H3ac， H2AK119ub和H2BK120ub的增加有关。同时，野生型USP11的过量表达能够抵消与内源性USP11敲低相关的H2AK119ub、H2BK120ub和H3ac水平的增加，而USP11/C318S的过量表达则没有这种效果。
研究结论：USP11需要及时清除DNA损伤时DSB位点的组蛋白泛素化和乙酰化，而且USP11这样做取决于其去泛素化酶的活性，并通过其与NuRD复合物的物理和功能联系。
5.USP11催化的组蛋白去泛素化在DNA损伤反应中的功能意义
BRCA1和53BP1的IRIF分别代表两个主要的DSB修复途径，即HR和NHEJ。为了进一步证明USP11催化的组蛋白去泛素化并探索其在DNA损伤反应中的功能意义，稳定敲低USP11的U2OS细胞与对照、USP11或USP11/C318S 质粒共转染。免疫荧光染色后进行高内涵显微镜观察表明，在DNA损伤修复期间，USP11敲低与H2AX、BRCA1和53BP1IRIF的增加有关，表明USP11敲低细胞的修复效率受损。同时，野生型USP11，能够回补USP11敲低诱导的DNA修复因子的保留，表明USP11对修复因子募集的影响取决于其去泛素化酶活性。为了进一步探究USP11对DDR的影响程度，分别使用基于GFP的染色体报告基因检测来测量两种稳定细胞系DR-GFP-U2OS和EJ5-GFP-HEK293中的HR或NHEJ修复效率。HR修复效率体现在转染了内切酶I-SceI的U2OS细胞中表达GFP蛋白的细胞百分比。USP11敲除导致GFP阳性的U2OS细胞的相对百分比下降。类似地，与EJ5-I-SceI稳定整合的HEK293细胞中USP11的敲低导致GFP阳性细胞的百分比显着降低，RNF20或BMI1敲低回补了USP11敲低细胞中NHEJ修复的缺陷。
然后作者验证了USP11的去泛素化酶活性是否是其参与DDR所必需的。为此，DR-GFP-U2OS细胞与I-SceI质粒和靶向USP11的siRNA共转染。FACS分析表明，野生型USP11（而非USP11/C318S）能够回补因内源性USP11耗尽而导致的HR修复效率降低。同样，USP11的过表达，抵消了USP11敲低细胞中 NHEJ 修复的不足。
研究结论：USP11参与了DNA修复因子的及时分解以及依赖于其去泛素化酶活性的有效 HR和NHEJ修复。
6.USP11是染色质凝聚和基因组稳定性所必需的
鉴于USP11催化的组蛋白去泛素化在DNA损伤反应中的重要作用，作者认为USP11与泛素信号的清除和随后在DNA修复后期的染色质恢复有关。作者在X射线产生的IR处理下，在USP11敲低U2OS细胞中进行了微球核酸酶（MNase）敏感性试验。USP11的敲低导致在IR暴露后的所有恢复时间点上，染色质的MNase敏感性明显增加，这种差异在IR后8小时非常明显。同时，Mi-2的敲除也导致了染色质可及性的增加，Mi-2和USP11的同时敲除加剧了这种情况。此外，对Giemsa染色的染色体进行分析表明，无论有无CPT处理，敲除USP11都会引起染色体畸变的显著增加，表明USP11在功能上参与了基因组稳定性的维护。作者还探究了USP11对细胞凋亡和对DNA损伤剂的生存的影响。流式细胞仪分析显示，敲除USP11促进细胞凋亡，而CPT或VP16处理加剧了USP11耗竭诱导的细胞凋亡。同时表达野生型USP11，但不表达USP11/C318S，在一定程度上减轻了USP11耗竭下的细胞凋亡促进作用，表明USP11在细胞凋亡中的作用取决于其酶活性。
此外，作者将稳定去除USP11的HeLa细胞暴露于不同剂量的X射线红外。发现USP11的缺乏与对IR反应的细胞存活率明显受损有关。作者还发现RNF20或BMI1的敲低恢复了USP11敲低细胞对IR暴露的敏感性，证明H2BK120和H2AK119去泛素化对USP11介导的细胞生存很重要。同时，USP11敲除对细胞周期曲线没有明显的影响，表明USP11对DNA损伤的诱导表型不是由于USP11对整个细胞周期进展的影响。这些结果表明，USP11保护细胞免受基因毒性的伤害，并促进细胞的生存。
研究结论：USP11是一种重要的染色质修饰剂，其作用是保护细胞免受基因毒性的伤害，并有助于染色质的凝聚、基因组的稳定和最终的细胞生存。
结论与讨论
作者报导USP11是H2AK119和H2BK120的去泛素化酶。同时表明USP11与NuRD复合物在物理上相关，并且在功能上与有效的DNA修复相关。作者还证明USP11可保护细胞免受基因毒性损伤，并且是染色质凝聚、基因组稳定性和细胞存活所必需的。
Thank you!
原文链接：https://europepmc.org/article/MED/31504778
