盘点工具慢病毒感染细胞前必做的几件事～

目的基因在细胞水平上的导入方式可以通过瞬转的方式进行，但想要长期在目的细胞中研究基因功能，可通过将外源DNA/shRNA和抗性基因包装至工具慢病毒载体中，重组慢病毒载体通过感染细胞将目的片段及抗性基因片段整合到宿主细胞染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用抗性基因对应的抗生素对细胞进行筛选。建立了稳转细胞系可以降低频繁转染的成本、稳定实验结果、方便实验研究。

然而小伙伴在拿到病毒后却不知从何开始实验，亦或查阅几篇文献，匆匆就开始正式的感染实验，感染条件并非最佳条件，最终导致实验失败，反反复复，费时费力费钱，反而耽误实验进程。本期干货小编整理了用慢病毒感染细胞实验前的必做清单，希望对大家实验有所帮助！

一、 病毒MOI摸索预实验

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是在一个系统中感染病毒的细胞数和总细胞数的比值，通常需要MOI值越高的细胞越难被感染。一般把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均能表达目的基因。事实上，细胞对于某种病毒的MOI并非是固定的，与病毒生产过程及细胞状态都有极大的关系。故此，建议大家每次拿到病毒都要做MOI梯度摸索预实验。MOI梯度设置范围一般根据参考文献而来。在正式感染实验时选择最适合的MOI进行实验，可以极大提高后续实验的成功率。

一般建议用96孔板进行MOI摸索（可节省病毒和细胞）：

1、将生长状态良好的目的细胞消化计数后放入96孔板中，进行铺板，100μL/孔，放入37℃，5% CO2 培养箱中培养过夜。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于30%至50%，以在感染 3 天左右长满培养皿底部为宜。

a.针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右；b.针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右；

c.针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

2、病毒感染（1/2小体积感染法）：感染前，从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基（血清不影响病毒感染），如96孔板则加入50μL培养基，根据公式：每孔加病毒量（μL）=MOI×细胞数（感染时细胞数）/病毒滴度（TU/mL）×1000，计算不同MOI每个细胞孔需加入的病毒原液体积，轻轻混匀，对于需要加入polybrene的细胞，可同时加入适量polybrene。整个实验过程保持细胞形态清晰、生长良好、无污染，为了减小误差，推荐平行感染2~3个。综合感染效率及细胞状态进行MOI选择，选取感染效率最佳且细胞状态良好的MOI进行后续实验。

二、 助染剂（Polybrene）使用浓度确定预实验

Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，可提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率10%~30%。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此实验细胞是否适合Polybrene需要进行预实验摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～10ug/mL的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献进行预实验摸索，Polybrene最常用的工作浓度为4～8 μg/mL。

三、抗生素筛选浓度确定预实验

抗性选择：常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素、新霉素和杀稻瘟菌素等。

根据初步文献查找确定抗生素筛选梯度范围，用不同浓度的抗生素处理细胞，选取在抗生素作用时间内能杀死90%以上细胞的最低浓度作为工作浓度。

嘌呤霉素建议梯度范围：1～10ug/mL

新霉素建议梯度范围：100～1000ug/mL

杀稻瘟菌素建议梯度范围：1～30ug/mL

具体实验细节可参考干货文章：“稳转建系药筛细节盘点，你不清楚的细节都在这～”

细胞进行正式慢病毒感染实验之前最重要的预实验便是以上所示的实验，综合以上三个实验可以摸索到最佳的感染条件及筛选条件，为成功获取目标稳转株保驾护航。汉恒生物专营病毒工具十余载，可定制高效感染细胞的成品慢病毒工具、提供慢病毒包装系统、药筛抗生素、高品质Polybrene以及相关产品，欢迎大家随时咨询！