写在前面

    怎么说呢，这个系列就是把自己的homework拿出来晒一晒，也就是图一乐丢人现眼一下，因为本人能力和知识范围有限，难免会有错误，请谅解一下，也就是仅供参考。引文都有标注，如果有侵权的可以联系我。欢迎各位大佬多交流，提问题、指错误。要是能关注一波那就更好了！

关于冷冻电子显微镜技术发展的思考

——The Resolution Revolution阅读心得

1  冷冻电子显微镜

冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(cryo-electron  microscopy，cryo- EM），指在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面起到了极为重要的作用。[1]

1.1 冷动电镜的原理

冷冻电镜的基本原理就是把样品冷冻然后保持低温放进显微镜里，利用电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。[1]

1.2 冷冻电镜的发展

  电子显微三维重构技术起源于1968年，D.J.De Rosier和Aaron Klug在Nature上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4噬菌体尾部三维结构的著名论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。为了降低高能电子对分子结构的损伤，Kenneth A. Taylor和Robert M.Glaeser于1974年提出了冷冻电镜技术，并将其用于实验研究。在最近几年里，冷冻电镜技术有了革命性的进步，主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯等材料的加入使得可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比（SNR）。[1]

第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此10年前，冷冻电镜中普遍使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD把光信号转成电信号后得到图像，但是“电光—光电”转换的过程却降低了信噪比。直到2013年，程亦凡博士与David Agard把直接电子检测相机（electron direct detection device，DDD）用于冷冻电镜单颗粒电镜图像记录才解决了这个问题。DDD可以直接记录电子信号，无需进行电子-光学信号转换，保持了原始信号的强度，降低了点扩散效应。同时，冷冻电镜图像能够被记录为一堆电影帧，每个电影帧都在短时间内被记录。由于速度快，还能减少了样品漂移产生的图像模糊，提高电镜图像的分辨率。因此，用DDD纪录的图像分辨率高、信噪比高、信号强、读出速度快，解决了一直限制cryo-EM发展中的两个最困难的问题，使得许多生物大分子复合物可以以原子分辨率重建3D密度图。[1-3]

第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。而这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。[1]

1.3 冷冻电镜的应用

目前Cryo-EM可以进行单颗粒分析（SPA）、冷冻电子断层扫描（cryo ET）和微电子衍射（Micro ED）等多种应用。此处主要介绍进行单颗粒分析、冷冻电子断层扫描两种应用。

1.3.1 冷冻电镜单粒子法

冷冻电镜单粒子法，又称单颗粒分析（SPA, Single particle analysis），可以对具有对称结构的大分子进行研究，也适合于研究结构不规则的大分子复合物，对于分子量的上限无太大限制，理论上>100kD的分子在成像技术能够保证的情况下可以形成足够的对比以进行图像校正，而太小的分子则不容易进行图像分析。[4][5]

1.3.2 冷冻电子断层扫描

冷冻电子断层扫描(cryo-electron tomography,cryo ET)则可用来研究一定厚度的亚细胞器在天然状态下的内部结构，由于样品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的结构，也可以了解整个细胞不同层面的内部结构.[4]

2关于冷冻电子显微镜技术的思考与展望

冷冻电子显微镜技术已经发展成为一个成熟的方法，应用于各种复杂的生物分子体系的高分辨结构研究。相比于其它蛋白质三维结构的分析方法，快速冷冻的方法能使蛋白质更接近生理状态，同时，也能拜托对样品均一化以及结晶化处理等要求和手段的依赖，使得可检测的蛋白质范围大大扩展，通过不断地技术迭代与硬件升级，不断提高分辨率，优化图像的对比度，Cryo-EM应该能更加广泛的用于研究分子量极小的蛋白质以及具有不规则形状的复合物等，或许我们也可以对Cryo-EM进行改造或者扩展运用，例如，不依靠纯化的蛋白质溶液，依靠电子切片或断层扫描等技术，直接观察在细胞中的蛋白质结构。此外，我们也应该促进三种检测技术的融合发展，使得蛋白质三维结构的测定得以更加快速精确，检测范围可以不断扩大。从而增强我们对蛋白质等生物大分子结构及作用机制的理解。

参考文献：

[1] 黄岚青,刘海广.冷冻电镜单颗粒技术的发展、现状与未来[J].物理,2017,46(02):91-99.

[2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/562770178

[3] Nordgren, T. The resolution revolution. Nature 407, 462–463 (2000). https://doi.org/10.1038/35035186

[4] https://news.antpedia.com/p/222227101.html

[5] https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/electron-microscopy/life-sciences/protein-analysis.html