细胞房消毒方案-让您的细胞高枕无忧
细胞房消毒方案-让您的细胞高枕无忧
细胞形态异常主要原因有哪些？我们应该从哪些方面出发考虑，逍鹏生物以鱼骨模型为大家列举了六大考虑因素，今天我们将带领大家分析人为操作/环境因素。（点击此查看鱼骨图）人为操作和环境我们大致可以从以下几点进行考察分析：操作人员、细胞房、生物安全柜、显微镜置物台、二氧化碳培养箱、水浴锅、震动、灭菌锅。
人源污染及预防
从人身上掉落的颗粒达到104/分钟（颗粒直径0.5μm）
人类1小时会脱落3*104-4*104个细胞；1年大概会脱落3.6kg的死细胞。
人类的皮肤总面积约2m2，存在约1012个微生物；我们1g的排遗物中约有1012个微生物。
-摘自上海高中生物第四册第一章微生物
人源污染
那么我们如何避免这些呢？接下来继续探讨~
1. 细胞房着装要求
操作细胞培养物前后应洗手，穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染，还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。
正确的穿衣顺序：
① 换专用鞋
② 无尘手套（避免不洁的双手经穿着时沾附于无尘衣上）
③ 网帽（带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外，之后戴口罩遮住口鼻）
④ 无尘服（不要穿棉质衣服(脱落纤维)）
⑤ 鞋套
德克龙(聚酯)
2. 超净台试剂布局
超净工作台或安全柜里的物品摆放一般遵循以下右手使用习惯，并可根据特殊实验中增加物品进行相应的改动。
① 在工作台中部开阔区域放置细胞培养容器；② 移液器置于右前方易于取用的地方；③ 试剂和培养基置于右后方，便于吸取；④ 试管架置于中后部，用于固定其他试剂；⑤ 小型容器置于左后部，用于盛放废液。
适合惯用右手的工作人员的工作台基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面上物品的摆放位置。
3. 人为操作技巧
小心取用无菌实验物品，勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养，更需注明目前的代数，以及这是同一代中的第几盘。
细胞房布局技巧
1. 细胞房功能分区
理想的无菌操作室应划分为三部分：
a) 更衣室---放在外，主要提供更换衣帽，鞋子，口罩，手套等。
b）缓冲室---位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。目的是保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
c）操作室---放在内间，分为无菌操作室、培养室、准备室、清洗室、消毒灭菌室、储存室。
房间设置要求：各个房间高度适宜（不超过2.5m），顶部过高会影响紫外线的灭菌效果；大小适当，房间过大，清扫和消毒不便；过小，操作不便；墙壁应光滑无死角，以便清洗和消毒。
2. 细胞房设计原则及条件
设计原则：防止微生物污染和有害因素影响。
条件要求：封闭、正压：隔离门和空调系统
温湿度：培养箱内是37℃，饱和湿度；室内是温度18℃-26℃，湿度是45%-65%。
洁净度：空气洁净度等级是洁净空间单位体积空气中，以大于或等于被考虑粒径的离子最大浓度限值进行划分的等级标准。洁净度等级应在空态、静态和动态放大进行测试，使用尘埃粒子测试仪来测定。
3. 细胞房布局原则
摘自：《Culture of Animal Cells》
细胞房维护保养：
1. 每天检查并记录细胞房温度、相对湿度（细胞房温湿度记录表)，发现异常要及时报告并处理。
2. 生物安全柜或超净台维护：每年委托有资质第三方对生物安全柜或超净台进行风速、气流流型、高效测漏、尘埃粒子、沉降菌的检测。
日常维护：定期对生物安全柜或超净台进行尘埃粒子、沉降菌或浮游菌的测试，发现不合格及时更换滤网或进行维修。
3. 空调系统维护: 定时更换初中效过滤器，每年请有资质第三方对洁净室进行尘埃粒子、沉降菌或浮游菌、换气次数、高效测漏、压差等检测。
日常维护：按照要求定期监测尘埃粒子、沉降菌或浮游菌。
细胞房消毒方法
1. 细胞培养箱防菌试剂
Pharmacidal （IC-110100）
主要成分：Pharmacidal 是由筛选过的有机氮化合物组成，主要组成成分为：苄基二甲基辛基氯化铵、苄索氯铵、三羟乙基胺，并添加丙二醇等清洁消毒剂。
作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂质变性，分解细胞膜的双层磷脂质和增加细胞通透性，导致酶的灭活，蛋白质沉淀，与DNA和RNA产生反应。
特点： Pharmacidal 对大部分的细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
使用方法：
可消毒橡胶手套、超净台面、桌面、显微镜台、试剂瓶身等物体表面，喷涂完全湿润，不需擦拭，自然风干。
培养箱内壁喷涂完全湿润后，等待10分钟后，用无菌吸水纸吸干内壁上的残留液体。
2. 水浴锅、水盘防菌试剂
Aquaguard-1 Aquaguard-2
货号：01-867-1B 货号：01-916-1B
主要成分：苯甲酸钠 主要成分：2-溴代-2-**-1,3-丙二醇
Aquaguard-1
用来消毒培养箱中的水盘，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；无毒；对不锈钢无腐蚀性；不挥发。
用法：
1. 建议每两周进行一次系统的清洁和消毒培养箱。
2. 稀释100倍即可使用，即将1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。
Aquaguard-2
用来消毒水浴锅，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建议每周进行一次系统的清洁和消毒水浴锅。
2. 稀释500倍即可使用，即将1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。
3. 超净台、桌面、试剂瓶身消毒方案
灭菌方法
作用原理
优点
缺点
Pharmacidal 喷壶
季铵盐作用方式是使脂质变性。分解细胞膜的双层磷脂和增加细胞通透性，导致酶失活，蛋白沉淀，与DNA和RNA产生反应，可有效防止真菌、细菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生长。
灭菌彻底；无毒无
害；无刺激性；无
腐蚀性；可生物降
解
不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用，也不能与碘或过氧化物(如过氧化氢、磺胺粉等)同用，否则会抵消其作用。
酒精
乙醇的抗菌原理是使蛋白质变性
高效灭菌；价格
实惠
易挥发，作用时间短；有刺激性；易燃
新洁尔灭
（苯扎溴铵）
季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂，能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜，增加细菌胞浆膜通透性, 使菌体胞浆物质外渗,阻碍其代谢而起到杀灭作用。
可杀灭常见细菌、
真菌；刺激性低；
无腐蚀
不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用，也不能与碘或过氧化物(如过氧化氢、磺胺粉等)同用，否则会抵消其作用。
来苏尔
酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀，快速杀
灭细胞。
可杀灭常见细菌、
真菌
刺激性强，易使橡胶制品变脆变硬
滴露
酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀，快速杀
灭细胞。
可杀灭常见细菌、
真菌
刺激性强，易使橡胶制品变脆变硬
4. 细胞房空气消毒方案
灭菌方法
作用原理
优点
缺点
紫外线灯杀菌
波长在220-300nm的紫外线称为“杀生命区”，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。
能有效杀灭常见的微生
物如金黄色葡萄球菌、
大肠杆菌
穿透力差；有死角；与被照物的距离以不超过1.2m为宜；致癌
甲醛
熏蒸
它能与蛋白质中的氨基酸结合而使蛋白变性，使酶的活性消失。
灭菌彻底；不易燃、
不爆炸，不腐蚀金属
残留性大；致癌
过氧化氢
干雾灭菌
通过复杂的化学反应解离具有高活性的羟基作用于细胞膜，其强氧化性破坏组成细菌的蛋白质，使之死亡。
灭菌彻底；残留性小
有腐蚀；易爆；致癌
臭氧灭菌
高压电场使电子管的内外电极发生强烈电子轰击，导致空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有很强的活性，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠氧原子的弥漫性扩散达到杀菌之目的。
灭菌彻底；残留性小
费用较为昂贵
空气过滤
（恒温恒湿装置）
逐次使用不同孔径的滤膜将微生物过滤干净
除菌效果高；无毒
费用较为昂贵
5. 细胞房地面消毒方案
灭菌剂
作用原理
优点
缺点
Pharmacidal 喷壶
季铵盐作用方式是使脂质变性。分解细胞膜的双层磷脂和增加细胞通透性，导致酶失活，蛋白沉淀，与DNA和RNA产生反应，可有效防止真菌、细菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生长。
灭菌彻底；无毒无害；无刺激性；无腐蚀性；可生物降解
不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用，也不能与碘或过氧化物(如过氧化氢、磺胺粉等)同用，否则会抵消其作用。
84消毒液
84消毒杀菌最主要的作用方式是通过它的水解作用形成次**，次**再进一步分解形成新生态氧[O]，新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性，从而使病原微生物致死。
灭菌彻底；残留性小；价格便宜
有腐蚀
新洁尔灭
（苯扎溴铵）
季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂，能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜，增加细菌胞浆膜通透性, 使菌体胞浆物质外渗,阻碍其代谢而起到杀灭作用。
可杀灭常见细菌、真菌；刺激性低；无腐蚀
不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用，也不能与碘或过氧化物(如过氧化氢、磺胺粉等)同用，否则会抵消其作用。
来苏尔
酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀，快速杀灭细胞。
可杀灭常见细菌、真菌
刺激性强，易使橡胶制品变脆变硬
滴露
酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀，快速杀灭细胞。
可杀灭常见细菌、真菌
刺激性强，易使橡胶制品变脆变硬
细胞污染杀除试剂
细菌克星-抗生素
货号
抗生素
作用对象
使用比例
储存条件
03-049-1B
卡那霉素溶液（10mg/ml）
细菌（如G+、G-、支原体）
稀释:1:100
-20ºC
03-035-1B
硫酸庆大霉素溶液（50 mg/ml）
细菌（如G+、G-、支原体）
稀释: 1:1000
AMB室温
03-031-1B
青链双抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate）
细菌（如G+、G-）
稀释: 1:100
-20ºC
03-031-5B
青链双抗，10浓缩液（10X Conc., 100,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 100mg/ml, Streptomycin Sulfate）
细菌（如G+、G-）
稀释: 1:1000
-20ºC
03-032-1B
青链霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin）
细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释: 1:100
-20ºC
03-033-1B
青链霉素，两性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B）
细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释: 1:100
-20ºC
03-034-1B
青链霉素，新霉素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25mg/ml Neomycin Sulfate）
细菌（如G+、G-）
稀释: 1:100
-20ºC
真菌克星-抗生素
货号
抗生素
作用对象
使用比例
储存条件
03-029-1B
两性霉素（2500ug/ml）
真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释:1:1000 ~ 1: 10,000
-20ºC
03-030-1C
制霉菌素（10,000units/ml）
真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释:1:100 to 1:1000
-20ºC
03-032-1B
青链霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin）
细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释: 1:100
-20ºC
03-033-1B
青链霉素，两性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B）
细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）
稀释: 1:100
-20ºC
支原体检测试剂
EZ-PCR支原体检测试剂盒（货号：20-700-20）。
支原体检测试剂盒的特异性：
引物与美国国家生物技术中心(NCBI)数据库进行比对，并检测16S，rRNA靶区同源性。96种支原体具有相关序列同源性。
支原体杀除试剂
BIOMYC-1（货号：03-036-1B）、BIOMYC-2（货号：03-037-1B）、BIOMYC-3（货号03-038-1B）
方案一：BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）的使用方法：
1. 加 1ml的 BIOMYC-1 溶液至 100ml培养基中，保持受污染的细胞在混合液中培养 4 天。期间需加入含 BIOMYC-1 溶液的少许的新培养基；
2. 4天后，加1ml BIOMYC-2 溶液至 100ml 的新培养基中，并维持培养 3 天；
3. 以上是一个处理循环阶段，可继续2-3次如上处理循环。
4. 在处理过程中，细胞需要做支原体污染检测，以确认效果，从而适当减少实验过程。
方案二：BIOMYC-3（03-038-1B）的使用方法：
1. 加1ml BIOMYC-3至100ml培养基中；
2. 持续培养14天，期间每2-3天更换一次含BIOMYC-3培养基;
3. 14天后，用不含BIOMYC-3的完全培养基继续培养细胞14天后再做支原体检测。
经济考虑，用户选择一种方案即可；最佳方案是，客户先用方案一处理一周期，再用方案二处理一周期。友情提示：如果使用其中一种方案，不能根除支原体，说明该支原体可能在另一种方案的抑菌谱内；36，37，38三者联合可有效根除实验室95%以上的支原体污染。
黑胶虫杀除试剂
BIOMYC-1（03-036-1B）、BIOMYC-2（03-037-1B）、BIOMYC-3（03-038-1B）
三抗 03-033-1B（主要成分：青、链、两性霉素。）
黑胶虫杀除方案一：BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
加1ml的 BIOMYC-1和三抗溶液至100ml培养基中，保持受污染的细胞在混合液中培养4天。期间需加入含BIOMYC-1和三抗溶液的少许的新培养基；
4天后，加1mlBIOMYC-2和三抗溶液至100ml的新培养基中，并维持培养 3天；
以上是一个处理循环阶段，必要时可继续2-3次如上处理循环。
在处理过程中，细胞需要做支原体污染检测，以确认效果，从而适当减少实验过程。
黑胶虫杀除方案二：BIOMYC-3（03-038-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
加1mlBIOMYC-3和三抗溶液至100ml培养基中；
持续培养14天，期间每2-3天更换一次培养基;
14天后，用不含BIOMYC-3和三抗溶液的完全培养基继续培养细胞14天后再做支原体检测。
