通过 PCR 进行定点诱变

定点诱变是一种高度通用的技术，可用于以定制的方式引入特定的核苷酸取代（或缺失）。 该方法可用于常规克隆（引入或去除限制性位点）、调控元件作图（突变报告构建体中的启动子/增强子）、蛋白质功能分析（进行丙氨酸扫描诱变或关键残基的靶向取代） )，以及 SNP 分析（在质粒环境中引入自然发生的 SNP）。 该技术在这个 CRISPR 时代也高度相关； 定点诱变通常适用于质粒，但也可能有助于基因组编辑。 通常通过 CRISPR/Cas9 诱导的双链断裂的同源定向修复 (HDR) 将定制突变引入内源性 DNA。 这种定点基因组编辑需要与内源靶点具有高度同源性的模板，但为了便于修复，模板应能抵抗 Cas9 切割。 如果质粒包含模板，则可以使用定点诱变来突变 PAM 序列（对 Cas9 切割至关重要的 NGG 序列），从而使生成的结构对 Cas9 诱导的切割具有抗性。

图1.定点诱变技术

简而言之，可以在扩增整个质粒模板的 PCR 方案中使用引物（具有所需突变）将点突变引入质粒。 使用甲基化依赖性核酸内切酶（即 DpnI）去除母体模板，并用耐核酸酶的带切口质粒（PCR 产物）转化细菌。 从所得菌落中分离质粒，并筛选所需的修饰。 最后，对阳性克隆进行测序以确认所需的修饰和没有额外的修饰。

图2.质粒的定点诱变。 A) 诱变质粒的产生。 PCR 引物（绿色）扩增质粒模板（蓝色），并引入限制性位点“A*”（除了父载体中已有的“A”位点）。 还显示了位于目标区域两侧的“B”限制位点。 在 PCR 扩增后，通过 DpnI 限制性消化去除模板，只留下诱变质粒。 尽管人们普遍认为 PCR 反应的最终产物是带有交错切口的双链环状 DNA 片段，但最近的数据表明 PCR 最终产物是线性双链 DNA 片段，具有同源末端。 这些同源末端在体内重组，得到如图所示的最终环状质粒产物。 B) 为目标突变筛选回收的质粒。 预期限制性分析结果（左）和验证 PCR 后进行限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析（右）的凝胶电泳图。 与亲代质粒消化产物（蓝色）相比，当用酶“A”消化定点诱变产物（绿色）时，引入限制性位点“A*”会产生额外的条带。 用酶“B”消化检测引物多聚化（紫色），下部条带（包含突变的质粒部分）大小的增加证明了这一点。 使用 (A) 中箭头指定的引物通过 PCR 筛选可以获得类似的结果。