文献解读 | 单细胞时空转录组技术鉴定胎肝HSC/MPP扩增单元

在哺乳动物中，造血干细胞和多能祖细胞(HSCs/MPPs)占据造血系统的顶端[1]，表现出多向分化和自我更新的能力。然而在目前的HSC/MPP体外扩增培养中，如何维持HSC/MPP的体外扩增依然存在挑战。高度血管化的胎肝(FL)是各种来源造血细胞(HCS)的短暂发育场所。FL结构的生态位细胞，包括内皮细胞(ECs)、基质细胞和肝母细胞。然而，HSC/MPP和不同的niche cells之间复杂相互作用的机制，以及HSC/MPP扩增的系统调控网络仍然不清楚。为了研究HSC/MPP扩增的调控机制，文章结合单细胞转录组测序(scRNA-seq)、空间转录组测序(ST)构建了小鼠FL的时空转录组图谱，揭示了HSCs/MPPs的转录异质性，解码了HSC/MPP扩增的结构和分子基础。此外，跨物种比较分析确定了小鼠和人类FL血细胞产生过程中保守的和特异性的细胞和分子事件。

 基本信息 

标题：Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics

材料：小鼠胎肝（FL）在E11.5到E14.5之间隔天取样

期刊：Cell Research

发表时间：2021年8月

方法：10× Genomics scRNA-seq，10× Visium , Stereo-Seq

 内容概述 

现有研究对造血干细胞和多能祖细胞(HSC/MPP)在其天然生态位内扩增的细胞和分子机制了解有限，因此，文章构建了小鼠胎肝(FL)的时空转录组图谱。作者使用小鼠胎肝单细胞转录组数据揭示了三个转录异质性的HSC/MPP亚群，其中一个CD93富集的亚群表现出增强的干细胞特性；与空间转录组数据进行综合分析，鉴定了新的HSC/MPP“pocket-like”单位(HSC Plus)，它由niche cells(肝母细胞、基质细胞、内皮细胞和巨噬细胞)组成，并富含生长因子。巨噬细胞在pocket-like单位显著富集，后续巨噬细胞-HSC/MPP共培养实验验证了巨噬细胞和生长因子（MDK，PTN，IGFBP5）对MSC/MPPs扩增起到促进作用。人鼠跨物种分析表明，小鼠与人胎肝HSC/MPP之间存在保守的细胞间互作和扩增机制，但是转录特征上存在差异。

 具体研究内容解析 

1.构建小鼠胎肝的单细胞转录图谱

作者选择E11.5至E14.5龄的小鼠胎肝（FL）每隔一天进行取样。为富集HCs和ECs，作者使用荧光分选从胎肝中筛选出HCs、ECS、非造血，非EC细胞并按一定比例混合进行单细胞测序。经过数据质控，作者共获得32449个细胞进行UMAP降维分析。根据基因表达特征，共鉴定到18个HC细胞亚群和3个结构生态位细胞亚群，不同的细胞群均表现出不同的基因表达特征，且他们的比例与发育阶段动态相关。随后，作者通过对四个发育时间点的细胞群进行差异分析和富集分析，构建了胎肝发育过程中HSCs/MPPs和结构生态位细胞在细胞组成动力学、细胞类型特异性基因表达及阶段特异性生物学功能的整体理解。

Fig 1 发育中的小鼠FL的单细胞转录组图谱

2. CD93富集的HSCs/MPPs增强干细胞特性

为进一步剖析HSCs/MPPs的转录组特征，作者聚焦在HSC/MPP1–3亚群来探索他们之间的根本差别。通过对HSC/MPP1–3亚群进行差异基因分析、GO功能富集分析和hscScore干性打分分析，作者发现相较于HSC/MPP2–3亚群，HSC/MPP1亚群表现出了最强的干细胞转录组特征。此外，作者发现HSC/MPP1亚群特异性表达Cd93。为探究Cd93能否与其他HSC/MPP标记物（如Lineage– Sca-1+c-Kit+(LSK), Flt3– LSK, and CD150+CD48– LSK (SLAM-LSK））进行组合来纯化具有强大干细胞特性的HSC/MPP，作者进行了随后的实验。作者发现E14.5的Flt3– LSK细胞可分为CD93+和CD93-细胞群，菌落形成单位（CFU）分析表明 CD93+（CD93+LSK, CD93+Flt3– LSK, and CD93+SLAM-LSK）细胞群表现出了更强的菌落形成能力。

Fig 2 CD93富集的HSCs/MPPs具有增强的干细胞特性

3．整合scRNA-seq和ST解码HSCs/ MPPs与生态位细胞之间的相互作用

作者使用CellPhoneDB构建了HSC/MPP-niche cell的相互作用网络，并聚焦niche cell与macrophages。除了一些已知的配体-受体关系对之外，作者也发现了一些新的与细胞生长、细胞因子识别、Notch信号相关的配体-受体对。为探究单细胞所预测的信号相互作用是否确实存在于解剖学上的组织细胞之间，作者对E14.5时期的组织制备了10x Visium切片。为了不偏不倚地显示主要细胞类型的空间组织，作者通过对来自scRNA-seq的细胞类型特征基因的每个spot分配一个富集分数来进行反卷积分析，而后根据前两种细胞类型的富集分数显示两种spot模式(第一模式和第二模式)，然后映射到原FL区域。与预期一致，红细胞和成肝细胞在大多数部位的富集分数最高，表明他们是FL的主要细胞成分。为了明确HSCs/MPPs及其相互作用的生态位细胞的空间组织，作者认为spots只是一种可信的细胞类型，如果某种细胞类型超过阈值（HSC、MPP为80%，niche cell为70%），则将他们映射到原FL区域，随后，作者还通过特异性基因表达对结果进行了验证。结果表明，ST描述了FL的空间组织，以进一步解码由scRNA-seq预测的细胞与细胞之间的相互作用。

Fig 3 整合scRNA-seq和ST解码HSCs/MPPs和生态位细胞之间的相互作用

4．识别HSCs/MPPs扩增单元

为了确定细胞间相互作用的结构基础，作者将HSCs/MPPs spots定义为内点（intra）， 内点周围一圈spots为近端点（inter）， 其他spots为远端点(distant)，然后根据富集得分来识别各个spots的细胞类型（富集得分最高）。除了HSCs/MPPs外，内点得分最高的是EC，与HSCs/MPPs接近；肝母细胞和基质细胞分别在近端点和远端点中得分最高；巨噬细胞在内点和近端点中的得分高于远端点中的得分，因此巨噬细胞可以考虑是一种新的niche cell。为了量化比较HSCs/MPPs与其他niche cell之间的相互作用 ，作者定义了富集倍数的概念：即每一种spot类型富集打分的中位值与全部spots富集打分中位值的比值。结果发现，巨噬细胞在内点的富集倍数是11.52，在近端点的富集倍数是1.31；EC在内点的富集倍数是1.62；而肝母细胞和基质细胞的富集程度更低 。综上所述，巨噬细胞是与HSCs/MPPs关系最密切的重要生态位细胞。

在分子水平，作者使用CellPhoneDB分析来预测相互作用信号的空间表达，结果发现一些基因编码的配体基因在内点和近端点中高表达，而对应的受体在HSCs/MPPs定位的spots中高表达，说明空间邻近促进了信号的相互作用，从而在功能上支持HSCs/MPPs的扩增。鉴于内点和近端点具有空间临近和相互作用信号丰富的特点， 作者将其定义为扩增单元，其中HSCs/MPPs位于spots的核心，与周围的niche cell spots相互作用。

Fig 4 识别HSCs/MPPs扩增单元

5．niche cell在促进HSC/MPP扩增中的功能验证

为了确定巨噬细胞在FL中如何调节HSC/MPP的扩增，作者首先探究了HSCs/MPPs与巨噬细胞的空间关系。免疫荧光实验揭示了两种空间模式，一种是HSCs/MPPs与巨噬细胞附着，一种是HSCs/MPPs被巨噬细胞包围。后一种模式提示巨噬细胞可能通过形成一种“口袋状”的结构来促进HSC/MPP的扩增。通过HSC/MPP与巨噬细胞及富含巨噬细胞衍生物MDK的培养基共培养，作者发现HSC/MPP扩增增强，而巨噬细胞耗尽则扩增减弱。为了确定哪种巨噬细胞类型与HSCs/MPPs密切接触，作者分别使用了生物信息学分析、免疫荧光成像和共培养实验进行探究。结果表明Mac1和Mac2起源于HSCs/MPPs和EMP，在促进HSCs/MPPs扩增中发挥了重要作用。

除巨噬细胞之外，作者还在10x Visium ST结果中发现了内皮细胞与HSCs/MPPs在空间上的紧密联系。免疫荧光实验揭示了HSCs/MPPs被内皮细胞包围，并且，大部分HSCs/MPPs靠近被EphrinB2标记的动脉门血管，少部分靠近被EphB4标记的肝静脉。HSCs/MPPs扩增实验表明，在IGFBP5-和PTN补充的培养体系中，HSC/MPP的扩增更为显著。

综上所述，功能分析验证了潜在的细胞-细胞相互作用和潜在的分子机制支持HSC/MPP扩增。

Fig 5 巨噬细胞促进HSC/MPP扩增

Fig 6 结构生态位细胞促进HSC/MPP扩增

5．小鼠与人FL血细胞生成的跨物种分析

为了分析人和小鼠的FL血细胞生成的保守性和差异，作者对小鼠FL的单细胞数据与近期发表的人FL单细胞数据进行了比较分析。数据整合分析和细胞类型鉴定结果表明，小鼠和人FL之间具有保守的细胞类型和造血分化途径。为了比较人和小鼠两个物种间HSCs/MPPs的转录组特征，作者分别对两个物种的HSCs/MPPs与其他细胞群进行了差异分析和GO富集分析，结果表明，两个物种间HSCs/MPPs的转录组特征总体上具有相似性，但对外界刺激的适应性反应也存在物种特异性机制。

Fig 7 鼠与人FL血细胞生成的跨物种分析

 研究结论 

文章的研究结果揭示了HSCs/MPPs的异质性、扩增的有利因素和结构基础，以及在小鼠和人类中保守的扩增机制，为研究HSCs/MPPs的扩增提供了宝贵的资源。对这一资源的进一步分析将有助于阐明胎儿起源的血液系统恶性肿瘤的机制。

 参考文献 

[1] Yamamoto, R. et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell 154, 1112–1126(2013)

[2] Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics[J]. Cell research.

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单细胞生信研发部  撰文

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