USP8介导EPG5的去泛素化以维持胚胎干细胞干性

写在前面

        今天推荐的是由中国科学院干细胞与生殖生物学国家重点实验室团队在2019年4月1日发表于Nature Communications（IF：12.117，JCR 1区）的一篇文章，通讯是Tongbiao Zhao教授，研究表明USP8与EPG5相互作用并介导其去泛素化，从而调节ESCs干性。

研究背景

        自噬是真核细胞中一个高度保守的溶酶体介导的分解代谢过程。基础自噬可以去除错误折叠或易聚集的蛋白和受损的细胞器，这在维持细胞稳态方面具有重要作用。     

        胚胎干细胞(ESCs)可以无限增殖，并保持分化为任何体细胞和生殖细胞的潜能。研究发现ESCs保持较高的自噬通量，以确保快速增殖和自我更新。此外，基础自噬已被证实可以降解小鼠ESCs中的线粒体，从而维持线粒体动态平衡。研究表明，高自噬通量是ESC的内在特征，并在ESC的自我更新和多能性中起关键作用，然而其中的潜在机制仍不清楚。

摘要部分

        作者筛选了小鼠ESCs中促进自噬的分子，并确定了EPG5。EPG5是一个真核特异性的自噬调节因子，其介导自噬小体/溶酶体融合。研究表明，EPG5在ESCs中高表达，并有助于维持ESC干性。作者还发现去泛素酶USP8与EPG5的Coiled-coil结构域结合。机制上，USP8直接从EPG5的K252位去除非经典的K63-泛素链，从而增强EPG5和LC3的相互作用。作者的这项工作揭示了泛素化和自噬之间新的交叉通路。

研究内容

1.EPG5对ESC的自我更新和多能性至关重要     

        作者通过转录组数据筛选了体细胞和ESCs中一系列自噬调控基因的表达，发现EPG5在ESCs中高表达。通过定量PCR和WB检测，作者证实了Epg5的mRNA和蛋白水平在ESCs中都有较高表达。     

        作者敲除了小鼠ESCs中的Epg5。利用克隆形成实验，作者发现ESCs中Epg5的缺失显著抑制了克隆形成效率，但不影响ESC凋亡和分化标志基因的表达。

        实验显示，与EPG5+/+ ESCs相比，EPG5-/- ESCs的多能性基因表达减少，这表明EPG5的缺失导致ESCs的多能性受损。此外，EPG5-/- ESCs显示出异常的胚体分化，其特征是某些中胚层标记基因的延迟表达。

研究结论：EPG5在ESC的自我更新中起重要作用，同时EPG5还是ESC多能性的关键调控因子。

2.EPG5的coiled-coil结构域调控ESC特性     

        作者接下来探究EPG5是否调节自噬通量，高的自噬通量可以维持ESC的自我更新和多能性。实验结果表明，EPG5的耗尽显著降低了ESCs的自噬通量。通过生信分析，作者发现EPG5有一个coiled-coil结构域，其可作为细胞信号转导的识别系统。

        作者制备了缺乏coiled-coil结构域的EPG5突变体(ΔCCD)。结果发现在EPG5-/- ESCs中表达WT Epg5，而不是ΔCCD Epg5突变体，可以恢复减少的自噬通量，并改善缺陷的自我更新和多能性。

研究结论：EPG5的coiled-coil结构域对于维持ESC特性至关重要。

3.EPG5直接与USP8相互作用   

        作者合成了一种与小鼠EPG5的coiled-coil结构相对应的多肽，并将其作为诱饵捕获EPG5相互作用的蛋白。LC-MS/MS分析鉴定出一种去泛素酶USP8，其涉及线粒体质量控制、核内体运输和细胞增殖。

        然后作者在293T细胞中转染了Flag-EPG5和/或HA-USP8，co-IP结果显示，USP8与EPG5免疫共沉淀。作者进一步证实了EPG5和USP8在ESCs中的相互作用。作者还发现ESCs中内源性的EPG5也能被USP8免疫沉淀。

研究结论：EPG5与USP8结合，并在ESCs中相互作用。

4.ESC特性的调控需要USP8     

        WB显示USP8在小鼠和人类多能干细胞中均高表达。作者发现等位基因Usp8▵/-中有13bp的缺失，而Usp8▵/- ESCs的USP8蛋白表达降低。实验显示，与WT ESCs相比，Usp8▵/- ESCs形成的克隆数量明显减少，而且Usp8▵/- ESCs中多能基因的表达减少。这些表明USP8对于ESC的自我更新和多能性至关重要。

        研究发现，WT Usp8使Usp8▵/-ESCs的集落形成能力得到恢复，而C748A突变体Usp8则未能恢复。类似的，WT Usp8可恢复Usp8▵/- ESC系中多能基因的表达，但C748A突变体不能。

研究结论：USP8对于维持ESC特性至关重要。USP8依赖其去泛素酶活性来调节ESCs的自我更新和多能性。

5.USP8通过去除K63-泛素链使EPG5去泛素化     

        作者发现，过表达Usp8使ESCs中EPG5的泛素修饰减少，而下调Usp8则增加了EPG5的泛素化。进一步研究表明，过表达WT USP8可完全消除EPG5的泛素化，但C748A突变体USP8不能。     

        实验显示，在转染EPg5和泛素的293T中，抗K63抗体能检测到泛素化的EPG5，但抗K48抗体不能。而K63突变为R63后极大地降低了EPG5的泛素化。此外，WT USP8有效去除了EPG5的K63-泛素化，但C748A突变体USP8不能。

        接着作者利用LC-MS/MS分析确定了EPG5中的六种赖氨酸可能与泛素结合。共IP显示，只有K252的突变消除了EPG5的泛素化。

研究结论：USP8直接去泛素化EPG5，USP8特异性去除EPG5上K252连接的K63-泛素链。

6.USP8调控EPG5和LC3之间的相互作用

        作者发现，Usp8▵/- ESC的自噬通量显著降低，而过表达Usp8的ESCs自噬通量更高。这表明USP8在ESCs中保护自噬通量。

        已知EPG5通过直接结合LC3介导自噬，作者接下来探究USP8对EPG5的去泛素化是否破坏EPG5与LC3的相互作用，并最终影响ESC干性。实验表明，Usp8的过表达增强了LC3和EPG5的相互作用。相反，抑制Usp8减少了LC3和EPG5的相互作用。

研究结论：USP8通过促进EPG5与LC3的相互作用来保护自噬通量以维持ESC特性。

结论与讨论

        本研究中作者定义了一种新的维持ESCs多能性的机制,并将ESCs的自噬和泛素化两个分解代谢过程联系起来。作者发现EPG5去泛素化USP8，这是ESCs自噬调控的基础。研究表明,USP8通过直接去泛素化EPG5来巩固EPG5与LC3的相互作用，从而维持ESC的正常自噬与干细胞特性。作者的发现扩展了对自噬和泛素介导的降解机制和功能的理解。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-09430-4