【星耀小课堂】一文全知道|提升PCR特异性扩增率
注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。前言前段时间好几天没有更新，因为菌菌“阳”啦，咳咳，这头疼发烧的日子真是一点都不好过，不知道大家的情况怎么样呢？那今天菌菌想跟大家聊聊的就是我们检测新冠病毒时候用到的手段——PCR特异性扩增技术，主要是带大家了解一下如何提高PCR特异性扩增率。原理部分想必不用再提，有遗忘的小伙伴赶紧点开笔记【星耀小课堂】PCR扩增技术原理复习哦。PCR扩增，polymerase chain reaction，聚合酶链式反应，顾名思义就是利用DNA聚合酶在引物起始下去延伸我们的目标产物，也就是DNA片段，其实就是一个个人为创造的DNA复制的过程。即使分子片段极小，也能经过数次循环扩增出许多产物，这就是它的高效之处。耀海生物在获取目的基因片段时通常采用PCR扩增技术，通常以质粒为模板，以同源重组引物进行PCR扩增，设置成熟的扩增体系与条件，扩增产物再经琼脂糖凝胶电泳分离检测。那讲PCR特异性扩增，我们先从它的反面来理解它。PCR技术的非特异性扩增是指扩增出来的条带不是我们所需要的，且引物与模板在非目的条带处有错配，导致延伸产物不是目的条带，表现在在琼脂糖电泳时可以看到在目的条带外出现了其他条带。
提高PCR特异性扩增的方法：
1.设计引物
引物序列的GC 含量以40-60%为宜，G+C过多易出现非特异条带，引物长度（primer length）常用的是15-30bp，常用为20bp左右。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C。关于引物设计相关要点菌菌此前介绍过，小伙伴直接戳【星耀小课堂】PCR扩增技术之引物设计要点。2.热启动PCRPCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸。Taq DNA 聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动PCR（hot start PCR）是指使Taq DNA 聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR，可提高反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。其基本方法是: 进行反应之前，将Taq DNA 聚合酶、dNTP 和引物等先不要加人样品管内，而是将样品加热，待温度升到70℃ 以上时，再将上述试剂加入，开始PCR反应。但这种延缓加入Taq DNA 聚合酶的手工热启动方法十分烦琐，最有效的方法就是使用热启动Taq酶(或热启动高保真聚合酶）去扩增，它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心，当温度上升到95°C时恢复活性，指导扩增。3.降落PCR退火温度过低则会使非特异扩增过多降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。具体方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前面几个循环的退火温度设定为比引物的最高熔解温度（Tm）高几度。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成。需要注意的是，虽然较高的退火温度能够防止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时也可能加剧引物与目的序列的解离，从而降低PCR得率。为克服这一问题，在最初几个循环中，通常会将每个循环的退火温度再降低1°C，以获得足量的目标扩增子。一旦退火温度达到或“降落”至最佳温度（通常比最低引物Tm低3-5°C），剩下的循环都维持此退火温度。4.巢式PCR巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段：第一对PCR引物（外引物）扩增片段和普通PCR相似。在目标扩增区域的侧翼，另一对（巢式引物）对应于待扩增的DNA区域。其中，外引物用于第一轮PCR，以扩增含有延伸侧翼区域的区域。随后，巢式引物用于第二轮PCR，并以第一轮PCR产物为模板。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。PCR技术具有许多的“变形”，但是万变不离其宗，它的“根儿”就是解链-退火-延伸三个步骤，只要牢牢把握这个核心，那关于它的优化技术也就很好理解了~菌菌身为耀海人，常常接触PCR技术，大家对此有任何疑问都可以咨询我哦~疫情当下，“小阳人”们记得不熬夜、多休息，照顾好自己，未阳的小伙伴坚持做好防护~咱们下期再见
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