实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

①根据实验需要，如果对特定mRNA进行逆转录，则使用Takara公司生产的TB GreenR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒（Code No. RR420A）。按照说明书，在冰上配制10 ul反应液，装于96孔无酶PCR板内，每孔反应液体系如下：

表2-7 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应体系

试剂      使用量

TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）      5 ul

PCR Forward Primer      0.2 ul

PCR Reverse Primer      0.2 ul

DNA模板      2 ul

RNase Free dH2O      2.6 ul

 PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer由上海生工公司合成，所有序列为文献验证或Primer Bank内提供序列，根据文献选择内参为GAPDH。内参U6和hsa-miR-1293的PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer由锐博生物设计，由于该公司对其具有专利，故不予公开。

②加样完毕后，贴上无酶PCR封板膜，用PCR刮板器将封板膜紧贴在96孔无酶PCR板上，瞬时离心3 min，确保反应液离心到无酶PCR板底部。如果有多板在无酶PCR板，在板边缘标注PCR板编号等基本信息，打开CFX Connect PCR仪，进行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应，程序设置如下：

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应反应条件

Stage 1：预变性      1 Cycle      

95℃       30 sec

Stage 2：PCR反应       39 Cycles      

95℃      5 sec

60℃      30 sec

Stage 2：熔解曲线分析      1 Cycle95℃

10 sec      65℃

5 sec      95℃

③内参为GAPDH，复孔至少设置3个，复孔之间的Cq值极差不应大于0.5，复孔之间Cq取均值。△Cq为同一DNA模板的目的基因与内参GAPDH之间的差值，即△Cq＝Cq目的基因－CqGAPDH。注意在计算前需要先查看复孔值，若复孔值之间差别太大则不可信。△△Cq为同一目的基因的实验组与对照组之间的差值，即△△Cq＝△Cq实验组－△Cq对照组。注意对照组内也要进行比较计算，以便确定对照组的组内差异是否过大，是否可信。以对照组目的基因的RNA相对表达量为1，实验组目的基因的RNA相对表达量用2^－△△Cq表示。