外泌体（Exosome）是一种由活细胞分泌到细胞外环境的膜性小囊泡，体内含有mRNA、miRNAs等非编码RNA和多种蛋白质。在病理条件下，受影响的细胞分泌的外泌体将失调的生物物质转运到靶细胞，导致细胞功能失调。其囊泡结构还可以保护外泌体中的核酸不受RNA酶降解，保留完整的RNA序列结构和生物活性。它作为体液活检标志物之一，近几年研究热度持续攀升，应用外泌体转录组学技术可以更全面、精准反映真实的转录组信息。目前广泛应用于疾病诊断及治疗中。

2023年03月08日，由首都医科大学附属北京天坛医院、斯坦福大学医学院（美国加州斯坦福）、中国神经疾病临床研究中心、北京大学国际医院以及首都医科大学友谊医院的研究团队联合发表在JouRNAl of Cerebral Blood Flow & Metabolism上（IF：6.690）为“RNA profiling of sEV (small extracellularvesicles)/exosomes reveals biomarkers and vascular endothelial dysplasia with moyamoya disease”的研究论文。本文首次探究了与烟雾病发病相关的外泌体RNA的差异表达，如hsa_circ_0001491hsa_circ_0051937的过表达，可能与烟雾病的血管生成有关；hsa_circ_0090577下调可能与血管闭塞有关。这些结果说明外泌体RNA在烟雾病中作为生物学标记物的效用。

研究背景

烟雾病（Moyamoya disease MMD）是一组以双侧颈内动脉末端及其大分支血管进行性狭窄或闭塞，且在颅底伴有异常新生血管网形成为特征的闭塞性疾病。其因异常侧支血管形成的机制尚不清楚，阻碍了烟雾病治疗药物的开发。

颅内动脉粥样硬化疾病（intracranial atherosclerotic disease，ICAD），其本质为各处脑动脉狭窄或闭塞性病变，ICAD作为缺血性卒中的主要病因，尽管发病率在近年来显著降低，但复发风险仍很高。为了确定有效治疗的新靶点，需要详细研究ICAD进展的分子机制。

试验设计

为探究外泌体RNA在烟雾病和ICAD发病机制中的作用。作者设置20例患病样本（A组：2例出血性MMD和8例缺血性MMD、B组：10例ICAD）和10名健康对照（10名参与者），用超滤方法提取血清衍生外泌体(serum-derived exosomes，SDEs)，使用基因芯片WT Pico试剂盒提取全RNA并建立RNA谱（青莲百奥提供技术支持）。探究6种候选RNA hsa_circRNA_0000583、hsa_circRNA_0090577、hsa_circ_0001491、hsa_circ_0076043、hsa_circRNA_0051937和hsa_circ_0074463对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascularendothelial cells ，HBMEC)的影响。

结果速递

1：全RNA谱质量验证及功能注释

文章选用四种尖刺探针（(BioB、BioC、BioD和CreX)、碱反应特征(可正可负)分析并验证总RNA杂交质量良好(P＜0.01)(图1(a)(b)(c)。

作者对样本间进行了差异基因表达分析。与健康对照相比，在烟雾病患者有1486个RNA下调，2405个RNA上调；ICAD患者有834个RNA下调，1001个RNA上调。与烟雾病患者相比，ICAD患者有2184个RNA下调，1261个RNA上调（图1（d）-（i））。

文章对烟雾病患者中的1486个下调RNA和2405个上调RNA进行了GO注释。注释结果显示，下调和上调的基因大都与免疫相关；此外，27个miRNA与中性粒细胞脱颗粒相关，表明烟雾病患者存在免疫功能障碍；12个下调的RNA被注释为免疫应答，其中一些还与补体激活的调节有关（图2（a））。在细胞组分方面有88种上调的RNA与细胞外外泌体显著相关，这表明细胞外外泌体可能在烟雾病的通路发生中发挥重要作用。在分子功能上，178个下调的RNA与蛋白结合相关，11个上调的RNA与RNA结合明显相关，提示烟雾病患者基因表达失调(图2（b))。RNA富集分析结果显示，烟雾病患者存在免疫功能障碍。8个下调的RNA与nod样受体信号通路相关，6个下调的RNA与toll样受体信号通路相关，它们都在炎症和免疫中发挥重要作用。此外，11种上调的RNA与分化簇分子显著相关。分子簇分子是用于鉴定和表征白细胞的细胞表面标记(图2（c))。

从差异表达的RNA中，作者在MMD患者(n＝5)和ICAD患者(n＝5)的SDEs中挑选了6个差异显著的RNA（表1）并对其进行了qPCR差异验证(图3（a）-（i）)。

2：候选RNA低表达细胞系的构建及小管形成活性验证

文章选择hsa_circRNA_0000583、hsa_circRNA_ 0090577和hsa_circRNA_0051 937作为候选RNA，以识别它们在MMD和ICAD中的功能。构建候选RNA低表达细胞系并用cck8试剂盒检测HBMEC在24h、48h和72h的活力。

如图所示，shRNA-NC组相比，sh-hsa_circrna_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937组细胞活力显著降低（图4）。

shRNA-NC组相比sh-hsa_circRNA_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937细胞凋亡明显增加（图5（e）、（f））。EdU细胞增殖试验表明 shRNA-NC组相比sh-hsa_circRNA_0000583、sh-hsa_circRNA_0090577、sh-hsa_circRNA_0051937 细胞增殖受到明显抑制图（图5（a）、（b））。

候选基因HBMEC小管的形成sh- hsa_circRNA_0000583、sh- hsa_circrna_0090577和sh- hsa_circrna_0051937组的小管和分支点的长度明显短于shRNA-NC组(图5（c）、（d）)。与shRNA-NC组相比，sh- hsa_circrna_0000583组、sh-hsa_circRNA_0090577组和sh-hsa_circRNA_0051937组的小管形成数量显著减少。sh-hsa_circRNA_0000583sh-hsa_circRNA_0090577和sh-hsa_circRNA_0051937组比shRNA-NC组高。

总结

文章测定烟雾病和ICAD患者的外泌体RNA谱，发现了几种与健康对照者表达显著差异的RNA。探索失调的RNA对HBMEC小管形成的影响也有助于理解这些RNA的失调如何影响烟雾病的发病机制，文章结果为研究烟雾病的生物学标志物提供了方向。