单细胞蛋白质组技术开启极微量蛋白组精细研究新时代
前言
细胞是生命体的最小组成单位，蛋白质是生命活动的执行者，而细胞内蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程有重要影响，不仅能为生命活动规律提供物质基础，也是理解细胞功能和发展过程的中心环节。传统的蛋白组学是针对组织或者大量细胞样本进行分析，获得的是均质化后的结果，掩盖了单个细胞的个体差异，而组织、器官或个体中，细胞具有非常大的异质性，传统的研究方法不能完全捕其复杂性、多样性以及功能的不同。
随着测序技术的发展，生命科学研究早已进入了单细胞时代，在mRNA水平已经可以很好的从单细胞的维度上探究细胞、组织、器官的发育过程和疾病相关的细胞异质性和同质性问题。但由于转录和蛋白相关性并不是太高，也不能完全反映蛋白的调控作用，所以要更好地理解细胞过程的调控机制，检测效应分子蛋白质比mRNA更直接有效，对于理解细胞的功能更为至关重要。近几年，特别是基于质谱方法的单细胞蛋白组技术的快速发展，在很大程度上可以弥补单细胞水平蛋白研究的需求。但是，单细胞蛋白组检测和分析技术主要面临两大挑战：第一大挑战是如何高通量的获取单细胞蛋白组样品。第二大挑战是如何准确检测和分析单细胞蛋白组样品数据。
于是，许多研究团队、公司竞相发力，单细胞蛋白质组分析技术从概念到科研、商用已经成为了现实。现在关于单细胞蛋白组的科研报告也越来越多，涌现出许多成熟的单细胞蛋白组定量技术，如：基于LC-MS/MS的TMT标记定量检测单细胞蛋白质组的技术：SCoPE-MS和nanoliter-scale shotgun mass spectrometry of single cells 技术、基于抗体的荧光定量技术：Cell Atlas和 Single-cell mass cytometry、基于WB的Single-cell western blotting以及基于PCR免疫分析的Proseek Multiplex技术和基于电子识别的nanopore protein sequencing技术。
下面小鹿选择了7篇具有代表性的文章，具体的详谈这些技术及其应用。
单细胞蛋白质组研究报道解读
一. 基于LC-MS/MS的TMT标记定量检测单细胞蛋白质组的技术：SCoPE-MS和nanoPOTS chips技术
SCoPE-MS单细胞蛋白组定量检测技术
代表文章
标题：SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.
期刊：Genome Biology (2018)
IF：14.028
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s13059-018-1547-5
技术说明
SCoPE-MS技术是以显微镜筛选的方法构建单细胞样品、并采用液质联用分析技术（liquid chromatography and tandem mass spectrometry, LC-MS/MS蛋白鉴定）和同位素标记定量（isobaric tandem mass tags, TMT标记定量蛋白组学 ）技术改进、组合而成。
材料和方法
研究者选用人的U937和Jurkat细胞品系进行细胞培养、单细胞样品制备和Bluk细胞样品制备（用以对比分析）、细胞超声破碎（超声波破碎优于化学试剂的破碎方法）、蛋白变性消化、TMT标记（技术手段）、LC-MS/MS扫描（技术手段）（混合上机）、MaxQuant搜库以及生物信息学分析。
研究结果
研究者采用SCoPE-MS方法对两种细胞谱系的细胞进行了单细胞蛋白组的定量分析，定量到767个蛋白，与Bluk细胞样品的定量结果相比是少了一些，但是比较二者的蛋白样品输入量也不是一个级别的。虽然定量到的蛋白数量少了一些，但是通过整合SCoPE-MS单细胞和Bluk细胞样品的蛋白定量数据，并进行主成分分析发现，SCoPE-MS方法是可准确的区分两种不同的细胞的蛋白质组。
nanoliter-scale shotgun mass spectrometry of single cells 技术
代表文章
标题：
Single-cell Proteomics Reveals Changes in Expression During Hair-Cell Development
期刊：eLife（2019）
IF：7.551
原文链接：
DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.50777
技术说明
研究者采用可以精确的定量到纳升级别nanoliter-scale 的nanoPOTS chip对单细胞的蛋白组样品进行shotgun mass spectrometry (LC-MS/MS（技术手段）) 扫描定量。
材料和方法
首先在E15鸡胚细胞样品中获取Hair cell和Support cell，然后用BD Influx Instrument (BD Biosciences) 筛选细胞后转移到纳米微孔(nanowells)中，其中细胞样品在纳米微孔芯片上的排列方式是可以通过BD FACS software environment软件上实现个性化定制，可以满足研究者的各种需求。在显微镜下，通过程序自动化识别nanowell内的细胞个数，而且可以通过SYTOX Red Dead Cell Stain (Thermo Fisher) 对活的细胞和死的细胞进行区分和筛选，从而达到优化实验的目的。定量到细胞蛋白质组实验数据之后，采用细胞发育轨迹(Developmental trajectory)的预测方法，研究progenitor cells到hair cell和support cell的细胞分化轨迹。
研究结果
研究者利用单细胞蛋白组定量技术检测鸡胚细胞样品，总共定量到3000多个蛋白，后续hair cell和support cell发育轨迹分析发现Marker蛋白表达量的动态变化（升高：OCM, CRABP1, GPX2,AK1, GSTO1；降低TMSB4X, AGR3 ）
二. 基于抗体的荧光定量技术：Cell Atlas和 Single-cell mass cytometry技术
Cell Atlas
代表文章
标题：A subcellular map of the human proteome.
期刊：Science （2017）
IF：41.037
原文链接：10.1126/science.aal3321 (2017).
技术说明
基于抗体的蛋白荧光定量检测技术
材料和方法
材料：抗体、人的细胞谱系。
方法：通过整合转录组数据和基于抗体的蛋白荧光定量检测技术构建人的细胞图谱，并最终用质谱的方法进行验证。
研究结果
在单细胞水平上定位了12003个人类蛋白质的30个亚细胞结构，从而确定了13个主要的细胞器蛋白质组。
Single-cell Mass Cytometry
代表文章
标题：
Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.
期刊：Science. (2011)
IF：41.037
原文链接：
doi:10.1126/science.1198704.
技术说明
利用荧光流式细胞技术对单细胞蛋白进行定量的技术
材料和方法
材料：
人外周血单核细胞(PBMC)
方法：
流式细胞仪技术的工作流程与荧光流式细胞仪技术类似，如下图所示，利用过渡元素同位素偶联的抗体结合细胞上和细胞内的目标靶点，将带有结合抗体同位素结合物的细胞以单细胞液滴的形式喷射到约5500 K的感应耦合氩等离子体（通过高频电流的感应线圈轰击氩气而产生）中。这会使每个细胞蒸发并导致其原子成分的电离。然后用飞行时间质谱仪对得到的元素离子进行取样和定量。当每个细胞的组成离子到达探测器时，每个过渡元素同位素报告器的信号被整合。
研究结果
流式细胞术是分析造血功能复杂性的重要工具。研究者使用单细胞“流式细胞术”来检测健康人骨髓，同时在单个细胞中测量34个生物学相关参数（31个抗体的结合、活性、DNA含量和相对细胞大小）。并用18个功能性信号状态的同时标记物监测跨越造血系统的细胞亚群的信号行为，这些功能性信号状态受到一组体外刺激和抑制剂的干扰。该数据集允许由表面抗原表达定义的相关细胞类型的算法驱动以提供细胞信号反应与药物抑制的叠加图。
用这种方式观察、分析揭示了先前未被重视的两种情况：精确的信号反应，它们被限制在传统定义的细胞亚群内；连续的磷酸化反应，它们以意想不到的方式跨越细胞群体边界，但却与细胞表型密切相关。
总的来说，这种单细胞分析提供了健康人造血中免疫信号的系统范围的数据，可用于机制研究和药理学干预。
三、基于WB的Single-cellwestern blotting (scWesterns) 技术
代表文章
标题：
Single-cell western blotting.
期刊：Nat Methods. （2014）
IF：28.467
原文链接：
doi:10.1038/nmeth.2992.
技术说明
单细胞蛋白免疫印迹检测技术(Single cell Westerns Blotting, scWesterns)，是对传统的蛋白免疫印迹(Western blotting)方法的精细化改进，实现了在单细胞层面上高通量的对于单细胞蛋白组进行免疫印迹检测、定量和分析，与传统的western blots不同，scWesterns方法可以精确量化了由外界刺激所引起的单个细胞的蛋白水平上的变化。
scWesterns技术应用可以应用于基础研究中细胞免疫应答、细胞分化等相关课题，也可以应用于医学领域，如药物研发中细胞实验阶段，可以整合上游功能或形态筛选、量化细胞对药物制剂 (包括罕见的循环肿瘤细胞) 的反应。
材料和方法
材料：
大鼠的神经干细胞(neural stem cell, NSC)。
scWesterns技术主要由单细胞微孔放置(settling of single cells into microwells)、原位裂解(lysis in situ)、凝胶电泳(gel electrophoresis)、光控蛋白免疫印记(photoinitiated blotting to immobilize proteins)、抗体探测(antibody probing)等技术组成，整个过程用时4h。
scWesterns实验整个过程都是在改造的显微镜载玻片(microscope slide)上进行，载玻片上有通过软光刻技术制作而成的可以固定单个细胞的凝胶槽矩阵，该阵列由16个模块组成，每个模块有14组微孔，每组有30微孔，总共达6720个微孔，在每个微孔中都是一个微型的反应器，对细胞矩阵进行光学扫描之后，将凝胶槽转移至微型电泳槽中，进行蛋白凝胶电泳。所以整个技术可以实现高通量的对单细胞蛋白进行western blotting检测和分析。
研究结果
研究者采用scWesterns技术对大鼠的神经干细胞(NSC)的分化和对有丝分裂原刺激的反应进行探究。研究显示NSC都显示出短暂的、动态的ERK和MEK磷酸化应答反应。
scWestern通过与靶抗体结合对靶蛋白进行定量，每个细胞可以检测阈值小于30000个分子的11个蛋白质靶点，并与荧光激活细胞分类结合时支持低起始细胞数（~200）的分析。
scWestern克服了单细胞蛋白质分析（即抗体保真度、灵敏度和起始细胞数）的局限性，或将成为研究单细胞分辨率下复杂细胞群的通用工具。
四.基于WB的Single-cellwestern blotting (scWesterns) 技术
代表文章
标题：
Simultaneous Multiplexed Measurement of RNA and Proteins in Single Cells.
期刊：Cell Reports（2016）
IF：7.815
原文链接：
http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2015.12.021
技术说明
通过构建的特制的寡核苷酸序列，在该序列一段结合特定的蛋白抗体，在荧光定量PCR反应中达到同时对单细胞的RNA和蛋白进行定量的技术。
材料和方法
材料：
Early passage U3035MG cells，是一种来源于胶质母细胞瘤患者的肿瘤细胞。
方法：
利用一种基于同质亲和力的邻近延伸分析法(homogeneous affinity-based proximity extension assay, PEA) 对蛋白质进行检测，该方法利用与寡核苷酸结合的抗体对蛋白质进行靶向检测，寡核苷酸的30个自由端是成对互补的，所以当同源抗体对与靶蛋白结合时，所附的寡核苷酸链将被拉近，并且可以通过聚合来扩展以产生可扩增的DNA报告分子，随后通过高通量实时PCR对其进行定量。对成对蛋白检测的要求保证了夹心免疫分析法检测蛋白质(sandwich immunoassay-quality protein detection)的质量。多重Readout是通过使用同源抗体结合物对的特异性引物对通过实时PCR解码延伸产生的DNA报告因子来实现的。
利用商业的TaqMan基因表达分析，使用实时荧光定量PCR的方法来探测转录物，同时实现检测定量蛋白质的方法。
研究结果
利用单个细胞的RNA和蛋白质组合数据，研究者证明了在神经干细胞条件下生长的多形性胶质母细胞瘤患者的低传代细胞培养群体中存在显著的异质性。其表达模式能准确区分对照细胞和BMP4处理的细胞。此外，还证明了RNA和蛋白质数据在定义细胞状态方面贡献是不同的。
五.基于纳米孔电子识别的nanopore protein sequencing技术
代表文章
标题：
Electrical recognition of the twenty proteinogenic amino acids using an aerolysin nanopore.
期刊：Nature Biotechnology（2019）
IF：31.864
原文链接：
DOI:10.1038/s41587-019-0345-2 BibTex
技术说明
用溶氧素纳米孔对20种蛋白源氨基酸的进行电特征识别
材料和方法
分子动力学模拟的应用表明，溶氧素纳米孔具有一个内置的单分子陷阱，将多阳离子载体结合的氨基酸完全限制在溶血素的传感区域内。这种结构特征意味着每个氨基酸在孔中花费足够的时间来敏感地测量氨基酸的排除体积。
研究结果
研究者用短的多阳离子载体检测溶氧素纳米孔中所有20种蛋白原氨基酸的离子电流。
小鹿推荐
通过研读这7篇单细胞蛋白组检测技术的相关文献，发现一个特点就是现存的单细胞蛋白组检测技术主要是对已经存在的技术的精细化改进而来的，例如SCoPE-MC、Proseek Multiplex 和scWesterns技术，不同技术各具特点。
近几年，随着质谱技术的发展，特别是基于tims tof平台将蛋白质组研究推进到全新的“4D蛋白质组”层面，打破了基于质谱的蛋白质组学研究的瓶颈，大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，为极微量蛋白样本检测提供了全新的研究手段。基于质谱方法的单细胞蛋白组技术的快速发展，在很大程度上可以弥补单细胞水平蛋白组高通量高深度的研究需求。相信得益于无损的微量样本前处理以及色谱系统的不断改进和提升，单细胞蛋白质组学在生命科学及疾病诊断、机制及治疗中会终将成为更加广泛的应用技术发挥关键性作用。同时，采用基于单细胞蛋白组研究手段能为极微量样本，比如微量单一类群细胞、微量穿刺样本、激光显微切割及其他珍稀样本的研究提供了更好的研究工具，为相关样本研究带来更高深更稳定更精准的检测结果。
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