酵母菌死活鉴别和数量测定

        显微直接计数法：将少量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

        显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等, 菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血细胞计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

        血细胞计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。

       每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血细胞计数板计数时，通常测定五（或四）个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。因此：每mL菌悬液中含有细胞数(cell/mL)=一个大方格的总菌数×10的4次方×菌液稀释倍数(d)。

        若要区分计数样品中的死菌和活菌值，则可采用微生物的活体染色法。活体染色法就是用对微生物无毒性的染料（如美蓝、刚果红、中性红等染料）配成一定的浓度，再与一定量的菌液混合，经一段时间后，死菌和活菌会呈现出不同的颜色，这样便可在显微镜下区分活菌数与死菌数。

        美蓝当它处于氧化态时呈蓝色，还原态时为无色。用它进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受氢后就由氧化态转变成还原态，因此活细胞呈现无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，故细胞呈淡蓝色或蓝色。

实验步骤:

1. 镜检血细胞计数板。

2. 血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一滴，使菌液渗入计数室 。

3. 将血细胞计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区，再转换高倍镜观察并计数 。

4. 计数时若计数区由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数。如为25个中方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格） 。

5.根据颜色区别死活细胞，染色30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化。

1. 镜检血球计数板（先10倍后40倍）

低倍镜（10倍）下观察→找到A的位置→高倍镜（40倍）下观察→找到B的位置→若计数室的格中不干净→擦净计数室（酒精棉C）

2.加菌液到计数区

3. 镜检加菌的计数室

4.按照左上→找出左上→右上→左下→右下→中间进行计数（25×16格）

注意事项:

1. 如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

2. 对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。

3. 清洗血细胞计数板：血细胞计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。