水溶性Cyanine菁染料偶联蛋白及体内成像

Cyanine菁染料是近红外荧光染料中最常用的一类荧光染料，细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小，能提供更高的特异性和灵敏度，菁染料是二个非区域电荷的氮原子通过聚合搭桥的方式形成的一种分子

由于Cy染料的结构式特点，他们往往有着极高的消选光系数，数值高达100,000 Lmol-1cm-1Cy系列的荧光染料我们一般分为磺酸化菁染料和非磺酸化菁染料non-sulfonated cyanines, and sulfonated cyanines.他们的光谱性质基本相同，和蛋白 小分子修饰反应也几乎是一样的，不同的在于他们的溶解性，非磺酸化菁染料是脂溶性的，磺酸化菁染料是水溶性的，结构式上也会有些不同。

Cyanine5 NHS ester-药物分子或小分子多肽用于小鼠活体成像实验
实验步骤如下：
SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄, 18～20克, 实验前24 h 自由进食、饮水。
于实验裸鼠腹腔内注射2%300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。
实验时将Cy7 或Cy7 标记的生物分子或药物DMSO 稀释后,于裸鼠尾静脉注射200μL( 0.5 mg/g) [最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化] ,每5min 记录1张动物在体内发射荧光的成像图片,分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。
Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通 ,发射波长790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm ,扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。
不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4~6 小时，快得只有30 分钟;如果是骨骼等部位靶点的Cy7 标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。
器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%固定4 小时以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。

（一）：Cyanine5 NHS ester和多克隆抗体的连接实验方法和步骤
【准备材料】：
Cy3 NHS ester purchased from xi an ruixi bio
anti-GST多克隆抗体purchased from Abcam
【实验步骤】：

1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL)，常温透析4小时。

2. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜。

3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小时。

4. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

5. 用0.1 M NaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 (IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 616.19) 溶液浓度为10 mg/mL; 计算所需体积以得到想要的Cy3 NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。

7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy5。

8. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。

9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。

10. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

11. 用0.01 M PBS/0.01 % 整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm(蛋白)和552nm(Cy)处的紫外可见吸光度。

12. 产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 溶液中，-20℃避光储存。
     

F/P计算：
Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000 M-1 cm-1;此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000 M-1 cm-1;
不同蛋白的摩尔吸光系数不一样;.Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm处的8%。按以下公式计算F/P
值。
[Cy3] = A552/150000
[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}
 
（二）：Cyanine5 NHS ester和标记 (D-ser2)-leucineenkephalin的连接实验方法和步骤
【准备材料】：
Cy5 NHS ester purchased from xi an ruixi bio
(D-ser2)-leucineenkephalin purchased from sigma
【实验步骤】：

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalinacetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)

2. 然后加入15 μL，常温避光搅拌反应混合物过夜。

3. 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 μL，30分钟梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相)

4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存;必要时可用质谱表征。

6. CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月;更长期的保存需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存.

F/P计算：
Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为 170
000 M-1 cm-1;Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。
[Cy5 dye] = (A650)/250 000
[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}

Cyanine3 alkyne
Cy3 alkyne
Cyanine3 azide
Cy3 azide
Cy3 N3
Cyanine3 carboxylic acid  1144107-76-5
Cy3 carboxylic acid
Cyanine3 hydrazide
Cyanine3 maleimide
Cy3 maleimide
Cyanine3 NHS ester   1032678-38-8
Cy3 NHS ester
Cyanine3.5 azide
Cyanine3.5 carboxylic acid  1144107-79-8
Cyanine3.5 NHS ester
Cy3.5 NHS ester
Cyanine5 alkyne
Cyanine5 amine
Cy5 amine
Cy5 NH2
Cyanine5 azide
Cy5 N3
Cyanine5 Boc-hydrazide
Cyanine5 carboxylic acid
Cyanine5 hydrazide
Cyanine5 maleimide
Cy5 maleimide
Cyanine5 NHS ester  1032678-42-4
Cy5 NHS ester
Cyanine5.5 alkyne
Cyanine5.5 azide
Cyanine5.5 carboxylic acid  1144107-80-1
Cyanine5.5 maleimide
Cyanine5.5 NHS ester
Cyanine7 amine   1650635-41-8
Cy7 amine
Cy7 NH2
Cyanine7 azide
Cy7 azide
Cyanine7 carboxylic acid
Cyanine7 maleimide
Cy7 maleimide
Cyanine7 NHS ester
Cy7 NHS ester
Cyanine7.5 amine
Cyanine7.5 azide
Cyanine7.5 carboxylic acid   1686147-68-1
Cyanine7.5 maleimide
Cyanine7.5 NHS ester
Sulfo-Cyanine 5 NHS ester
Sulfo-Cy 5 NHS ester
Sulfo-Cyanine3 azide
Sulfo-Cy3 azide
Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine3 maleimide
Sulfo-Cy3 maleimide
Sulfo-Cyanine3 NHS ester
Sulfo-Cy3 NHS ester
Sulfo-Cyanine5 alkyne
Sulfo-Cyanine5 azide
Sulfo-Cy5 azide
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid   1121756-16-8
Sulfo-Cyanine5 maleimide
Sulfo-Cy5 maleimide
Sulfo-Cyanine7 azide
Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine7 NHS ester
Sulfo-Cy7 NHS ester

小编YQ2020.12