文章复现丨惊！2021年5分生信文章，只用20分钟复现！怎么做的？答案藏在这里！

2021-05-10 13:56 作者:酸谈讲科研 0人读过 | 我要投稿

通过点、点、点出图的方式，利用仙桃工具复现最新发表的生信分析套路。今天为大家带来一篇于2021年2月份发表于Aging-UC（IF=4.8）的单基因纯生信文章。

通过对全篇文章内容的解构，Jerry将带领大家逐个步骤的复现全文7张生信图片，其中涵盖2张补充图片。
迫不急待了吧，现在开始吧！

材料与方法部分

数据资料来源

本篇文章的一部分数据来源于TCGA数据库，作者获取了437位肺腺癌患者和54位正常肺组织的表达矩阵（未说明数据格式）和临床数据；
另一部分数据则来源于GEO数据库，纳入了8个GSE数据集，其中GSE72094数据集因涵盖临床预后信息而作为本篇文章的验证数据集。
注：不同版本的TCGA数据，有可能获取的患者的样本例数不一致，因为TCGA数据库一直处于更新过程中。所以看到生信文章中TCGA里同一个癌种的患者样本数不一致，大家也不要奇怪，有可能就是版本不同导致的。
大家做生信分析的时候，尽量选择TCGA数据库中的最新版本的数据进行下载。

图表结果及复现

仙桃学术工具

Human Protein Atlas database

LinkedOmics数据库

TIMER数据库

GEO数据库

TISIDB database

复现任务

Figure1 CLEC10A在肺腺癌与正常组织间的差异表达情况；

Figure2 CLEC10A的表达与肺腺癌患者临床指标的相关性；

Figure3 CLEC10A在肺腺癌组织中的共表达基因（LinkedOmics数据库）

Figure4根据Timer和Estimate算法推断出CLEC10A的表达与肺腺癌组织内免疫细胞浸润的相关性；

Figure5 根据TISIDB数据，推断出CLEC10A的表达水平与肺腺癌肿瘤标本内淋巴细胞浸润、免疫调控因子和炎性趋化因子的相关性；

S.1 根据HPA数据库，证明CLEC10A在肺腺癌组织与正常组织间的表达差异；

S.2 根据Timer数据库，展示CLEC10A与多种肿瘤组织内免疫细胞浸润的相关性；

复现步骤
Fig.1 CLEC10A在肺腺癌与正常组织间的差异表达情况

仙桃学术复现进入仙桃学术生信工具主页，选择高级版，点击“立即使用”（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例）。▼

选择“分析工具”后，在左侧选择“表达差异”下的“非配对样本”。

在数据中选择肿瘤类型“TCGA-LUAD”，在参数中输入分子“CLEC10A”，并根据需要调整图形样式，点击“确认”，即可得到TCGA进行单基因差异分析的图片（图A中的非配对比较的TCGA结果和图D结果）。▼
非配对TCGA的差异分析，并点击“保存结果”按键，稍后可进行拼图

配对的TCGA差异分析，并点击“保存结果”按键

利用仙桃工具，展示CLEC10A在GEO数据集中的肿瘤与非肿瘤标本之间的差异表达
以下利用GSE75037数据集进行单基因差异分析的展示，首先点击数据库检索，键入GSE数据集名称，搜索到目的数据集，点击数据平台“GPL”信息，下载探针和基因名，再点击“数据下载”选项，选中Series Matrix file文件，其内包含了样本的基因表达矩阵和样本的分类。

根据GPL数据集的基因名确认相对应的探针名，单个基因有可能对应多个探针，则均需记录下来；

返回至GSE数据集，根据探针名检索出所有样本相对应的基因表达值；

对三个探针的表达值取相应的平均值，然后根据基础绘图的“配对图”选项下载示例数据，辅助整理正确格式的上传文件。

格式如下

根据癌旁组织与癌组织的类别，将CLEC10A的表达谱数据整理如下图所示：

上传至“配对图”选项下，即可得到如下结果

按照上述类似的操作，汇总7个GEO数据集和TCGA数据库的数据，利用拼图工具，简要汇总如下：

Fig.2 CLEC10A的表达与肺腺癌患者临床指标的相关性

在数据中选择肿瘤类型“TCGA-LUAD”，在参数中输入分子“CLEC10A”，选择临床肿瘤T分级，统计方法选择“One-Way ANOVA”，Y轴坐标标题注释，并根据需要调整图形样式，点击“确认”，但目前还不能将Anova的分析结果标记于图片上。（Fig. 2A）

上接步骤2截图的统计分析结果，如下图所示，其中“保存结果”按钮可以稍后进行图片组图，“方差齐性检验”为统计方法的选择提供依据，One-Way Annova的p值也展示在下述统计表格内。

其余步骤同步骤2，依次选择临床-N.stage、M.stage和UICC-stage，此处不再重复，并根据需要调整图形样式，点击“确认”即可，即可依次得到CLEC10A与临床指标相关性的图像。(Fig. 2B, C, D)

Fig. 2E-F的制作流程
选择临床意义下拉菜单的“单因素多因素COX回归”，再选中LUAD的测序数据，根据本文章的图示，依次选中T、N、M、gender、age和单基因名称（CLEC10A），并注意方框4中的内容，右侧的内容为比较组，而左侧内容为对照组，之后选中OS分析即可。

点击下载CSV表格，表格打开之后的概览如下图所示。

点击基础绘图中的森林图，并下载示例数据，以为数据整理提供参考；

根据上图表格的格式，并结合原文森林图的图示，将4.3步骤获得的数据分布整理为单因素Cox回归和多因素Cox回归的表格。

单击森林图，先后上传整理好的单因素和多因素Cox分析文件，点击确认，即可先后得到相应的单因素和多因素分析的森林图。

利用仙桃工具的拼图工具，得到如下图示：

Fig.3 CLEC10A在肺腺癌组织中的共表达基因（LinkedOmics数据库）

在线搜索LinkedOmics数据库，根据下图可先注册账号，再进行操作，这样获得的结果可保存于对应的账号中；但也可以直接点击作为访问者使用。

按照提示步骤，逐次选择肿瘤类型、RNA-Seq数据类型、特定类型的样本（可选）和基因名称-CLEC10A。

选择目标数据集（同样也是肺腺癌的测序数据）和统计方法（与文献提供的方法相一致），点击提交请求，获得结果。

选中获得的数据集结果，即可在下方看到LinkFinder数据块，可得到图3A、B、C。

选择LinkInterpreter模块，根据文章内容选择GSEA富集分析，分析条件选择默认即可得到图3中的E和F图像。

进入GEPIA 2版本的数据（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index），根据下述序号，点击进入“survival map”模块内，将图3B、C中获得的相关下调和下调基因输入3方块中，选择肺癌的TCGA数据集，点击绘图，即可得到图3D的结果。再将下调和上调的survival map图组合在一起即可，此处只展示出部分结果。

Fig.4根据Timer和Estimate算法推断出CLEC10A的表达与肺腺癌组织内免疫细胞浸润的相关性。

进入TIMER version. 1版本，在下方输入框中键入基因名称，cancer Type选中肺腺癌（TCGA的测序数据），免疫浸润为数据库默认的6中免疫细胞，即可一键得到下图所示的图像，点击JPG或PDF下载，此图即为Figure 4A。

Fig4.B图为GSE数据，需自行使用R语言的Timer算法进行计算，得到B图，此处不再演示。
Fig.4 C-F均为ESIMATE算法估算每个样本的免疫评分和间质评分，再将其与患者的预后做关联，目前只能依靠R语言的ESTIMATE算法进行实现。
进入仙球工具的临床意义板块，选择预后分析之KM曲线图，按照下述步骤，即可得到在TCGA-LUAD数据集里CLEC10A与患者预后的相关性。即Fig4. G。

在仙球学术之数据集检索框内键入GSE72094，即可看到相应的“数据下载“”按钮和GPL信息，分别点击数据下载》》series matrix file文件，用以获取CLEC10A的表达谱和生存信息；点击GPL选项，下拉至页面底部，点击view full table，按Ctrl+G在页面内搜索CLEC10A对应的探针号，在下图中可看到有两个探针对应CLEC10A，记录下来，再到series matrix file文件内找到上述两个探针对应的表达值，取其平均值，即为该基因的表达值。