Western Blot

1.相关试剂

5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸 94g，SDS 5g，加蒸馏水定容至1L，溶解后室温保存，使用时稀释为1×的工作液。

转膜缓冲液：Tris 3.03g，甘氨酸14.42g，甲醇200ml，加蒸馏水定容至1L，4℃保存，使用前预冷。

TBST缓冲液：1mol/L Tris-HCl（PH 7.5）150ml，NaCl 135g，吐温20 15ml，加水定容至15L，室温保存并使用。

1M Tris-HCl（PH6.8）:Tris 121.1g，定容至1L，用浓盐酸将PH值调至6.8。

1.5M Tris-HCl（PH8.8）：Tris 181.1g，定容至1L，用浓盐酸将PH值调至8.8。

10%SDS：SDS 10g，加蒸馏水定容至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存。

10%过硫酸铵（AP）：过硫酸铵0.1g，蒸馏水定容至1.0ml，溶解后4℃保存，保存时间为1周。

2.SDS-PAGE凝胶配制

（1）使用前用蒸馏水将两块玻璃板冲洗干净小心组装好并用水检漏。确定不漏之后将玻璃板的中的蒸馏水倒掉，并用注射器将里面的水吸干净。

（2）下层分离胶：根据蛋白大小选取合适浓度的胶，按照配方进行配胶。配好之后将液体混匀倒入玻璃板中（加到绿线即可，大概7.5mL），立即水封。放入烘箱中等待下层胶凝固。

（3）上层浓缩胶：待两液相出现折线，胶凝后将上面的水倒出，并用注射器将水吸干净。根据配方配置浓缩胶，配好之后混匀倒入玻璃板中（大概3mL），插入梳子之后放入烘箱中等待上层胶凝固。

（4）胶凝后将玻璃板转过来固定于电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔出梳子。

（5）将制备好的样品点入凝胶孔，一般浓缩胶以80V电压30min，分离胶以120V 90min。（具体时间根据实际情况而定）

3.转膜（湿转）

（1）将完成电泳的凝胶浓缩胶切掉然后放入转膜缓冲液中浸泡，同时滤纸也浸泡。PVDF膜放入甲醇中进行活化30s再放入转膜缓冲液中进行平衡10min。（0.45μm最经典的通用转印膜，0.22μm载量最高，适合<20KDa和低丰度蛋白的检测）。

（2）在玻璃板上铺海绵，七层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，贴上PVDF膜，再铺上七层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。将其整体转移到转膜仪上。

方向应为：阴极（黑色）-海绵-七层滤纸-胶-PVDF膜-七层滤纸-海绵-阳极（白色）

（3）将转膜仪中倒满转膜液，放入冰水中，开始转膜（根据蛋白的大小选用合适的电压和转膜时间）。

（4）关于转膜电压经验总结：快转：恒压100V，60min约可将90KDa以下的蛋白转印过去；恒流200mA，60min约可将90KDa以下的蛋白转印过去。

恒压60V，3h约可将胶上所有marker转印过去；

恒压40V，4.5h约可将130KDa以下的蛋白转印过去；

恒压13V，过夜（约13h）转膜可达到转印效果。

注意：整个转膜过程中在电泳槽周围放置冰袋，防止温度过高影响蛋白转印效果。

方向应为：阴极（黑色）-海绵-七层滤纸-胶-PVDF膜-七层滤纸-海绵-阳极（白色）

4.封闭

（1）配制10%脱脂奶粉或5% BSA封闭液，充分溶解后倒入孵育盒中。

（2）用镊子小心将膜夹出放入封闭液中，紧贴凝胶的膜面朝下放置。

（3）室温封闭2-4h或4℃封闭过夜（室温封闭时摇床以最慢速度摇晃）。

5.孵育一抗

（1）封闭过程完成后，将封闭液弃掉，TBST进行洗膜，洗涤三次，每次5min，将残余封闭液洗涤干净。

（2）然后将膜用镊子夹出平铺于一抗中，室温摇晃孵育4h或4℃孵育过夜。

6．孵育二抗

（1）一抗孵育完成后，将一抗回收并用TBST洗涤3次，每次5min。

（2）提前配制好二抗，一般稀释比例为1:4000，将膜平铺于二抗中，室温孵育1h（二抗注意属性来源是否正确）。

7. 洗膜，显影，定影

（1）将二抗弃掉，加入TBST进行洗膜，洗涤三次，每次5min。

（2）将A、B液按1：1配制，在一试管中各加400ul的A液和B液。

（3）将滤纸吸干TBST的膜上均匀涂布配制好的显色液，并放入成像仪中关好仪器仓门，根据蛋白表达丰度选择曝光时间并进行设置。

（4）对显色好的图片进行微调并保存到指定文件夹中。