动物模型 | 帕金森动物造模

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年人群中常见的神经退行性疾病，以中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元退行性变性死亡以及路易小体的形成为主要病理生理特征。PD的发病机制目前尚未阐明，可能与环境、遗传、线粒体功能障碍、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡等诸多因素有关。目前PD的治疗主要以改善症状的药物治疗为主，但仍然缺乏有效的根治措施，到了疾病晚期阶段，患者往往生活难以自理，因此给PD患者其所在的家庭及社会都带来沉重的负担。要进行PD疾病的研究，通常需要构建理想的PD动物模型。现有PD动物模型按照其处理方式主要分为三类：神经毒素模型（neurotoxic models）、转基因模型（genetic models）及二者联用模型。

动物的选择PD动物模型使用动物种类广泛、多样。按其具体分类，可大致分为四类，包括啮齿类、灵长类、其他哺乳动物（小型猪、狗、猫）和其他动物（秀丽隐杆线虫 （C.elegans）、果蝇、斑马鱼）。
啮齿类动物啮齿类动物在神经毒素模型中使用最为广泛，是经典的造模动物种类。其优点主要为:（1）大小适中，其解剖结构与临床症状与PD病人最为相似。（2）饲养条件简单，成本较低。（3）操作最为简单，伦理问题较少。
秀丽隐杆线虫、果蝇等生物秀丽隐杆线虫、果蝇等生物是转基因模型中最常使用的生物。其主要原因是由于这类动物结构简单，基因组信息较易获得，且生命周期较短。
灵长类动物灵长类动物（比如猕猴、狨猴等）在PD研究中使用较早，其优缺点分明，该类动物在每次实验中使用数量较少。其优点主要是该类动物与人类进化亲缘性最高，实验结果最为接近，但缺点是饲养、操作复杂，成本较高，且使用数量局限，涉及伦理问题较多。
造模方法1 神经毒素模型（neurotoxic models）神经毒素模型是最早使用在PD研究中的动物模型，也是目前最常用来评价PD治疗效果的手段之一。
优势：操作相对简单与较低的成本，在实际研究中使用较为广泛。
劣势：当神经毒素物质作用于动物机体后会迅速引起黑质、纹状体的严重变性，导致机体产生十分强烈的运动失调症状；但这些运动症状与 PD患者的运动症状具有较大差异。此外，由于其病程十分迅速，且病变主要为多巴胺能神经元坏死、缺失，所以该类动物模型一般不会观察到PD典型病理变化，即病变突触核蛋白在神经系统中的大量沉积。016-羟基多巴胺✦6-羟基多巴胺（6-OHDA）是一种结构类似于儿茶酚胺的物质，该物质具有亲水性，无法直接穿透血脑屏障，使用时须通过特定的定位程序，将该物质直接注射在目标区域内，一般为黑质、纹状体、内侧脑束。其具体作用机制为：该物质迅速引发非酶促氧化反应，抑制膜转运蛋白功能；导致大量氧化物质与神经递质蓄积，抑制呼吸复合物I的相关功能，破坏线粒体的正常运转，进一步导致多巴胺能神经元坏死、缺失，使机体神经系统出现退行性现象。该模型的特点是病程迅速，缺少渐进性病变与突触核蛋白沉积现象。
方法：使用该物质时，不同的注射方式通常会产生不同的病理变化与临床症状。当注射在纹状体时，神经症状通常表现较为缓慢，病程较轻，但当注射在黑质或内侧前脑束时，神经症状表现迅速，病程较重，可见明显的细胞变性、坏死；当单侧注射时，其运动症状较为明显且一般不会出现双侧运动障碍，利于实验者观察，并且通常不会导致脂质代谢紊乱、失语症状、焦虑症与嗅觉失灵，安全性较高，而双侧注射则不然，所以该模型通常选择单边注射，以期达到必要的实验结果。目前，该模型主要用于PD的细胞、分子水平研究，治疗效果评价等方面。021-甲基-4-苯基-1，2，6-四氢吡啶✦MPTP 主要破坏多巴胺能神经元，是一种高亲脂性、呼吸复合物 I 抑制剂。它可以轻松穿过血脑屏障，作用于大脑特定区域，导致运动症状。该物质无毒，可全身给药，获得实验性PD模型。其作用机制为：MPTP 与星形胶质细胞中的单胺酶B结合并氧化，最终形成有毒物质 MPP+；MPP+ 通过相应转运蛋白进入多巴胺能神经元中积聚，当到达一定量后，该物质通过囊泡转运蛋白进入突触小泡，最终抑制呼吸复合物 I 的功能，干扰线粒体电子传递链作用，最终导致 ATP 合成下降，线粒体损伤。
该模型最大特点为：病程渐进且与PD患者临床症状最为吻合；可观察到突触核蛋白沉积现象，而这一特点是目前大多数PD动物模型所不具有的。不同动物种类具有不同的 MPTP敏感性。灵长类动物较啮齿动物敏感性较高；啮齿动物中，小鼠敏感性最高，并且由于小鼠饲养条件简单，成本较低且操作简单，故 MTPT 小鼠模型使用最为广泛。
方法：不同注射方法也会导致不同的临床现象。单次高剂量脑内注射或重复低剂量腹膜内注射通常会导致黑质纹状体产生明显的多巴胺能神经元病变及较为显著的运动症状，而低剂量注射则可观察到渐进性多巴胺能神经元的损伤与相应的运动症状；不论是何种剂量，MTPT导致的运动症状一般是可通过行为学标准进行评估。2 转基因模型目前常用的制备手段的制备手段主要为基因敲除与转基因技术。有关PD遗传基因的研究发现：干扰或调控与线粒体和能量相关的特定基因会导致PD发生，并通过大量基因分析技术包括连锁不平衡分析、家系连锁分析和全基因组扫描等，由此推动与PD相关的20个相关基因与25个遗传因素的深入研究。
目前，可将PD相关基因划分为“ PARK“（18）和“非PARK”（＞20）基因。迄今为止，已有8个基因位点的基因序列被克隆，包括与常染色体显性遗传 PD相关基因（α-突触核蛋白、LRRK2、UCH-L1），与常染色体隐性遗传PD相关基因（Parkin、PINK1、DJ-1、HTRA2、ATP13A2）两类。通过转基因技术对这些相关基因序列进行操控可获得相关PD转基因动物模型，拓宽模型种类。
该转基因模型具体分为SNCA（α-突触核蛋白，PARK1和4），PRKN（parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase， PARK2）， PINK1（PTEN-induced putative kinase 1， PARK6）， DJ-1（PARK7）和LRRK2（leucine-rich repeat kinase 2，PARK8）。且在这些动物模型中，SNCA 模型最为常见，使用最为广泛。虽然在这些转基因模型中很少观察到黑质、纹状体等区域的神经损伤，但其为研究PD的病理变化和发病机理，以及从基因分子水平揭示PD发病机制提供了研究基础。01 α-突触核蛋白✦α-突触核蛋白是一种可溶性小蛋白，主要在中枢神经突触前与核周附近表达。其参与膜蛋白与囊泡调节的动态平衡。研究发现该蛋白相关基因在家族遗传性PD中起主导作用，称为 PARK1 基因。有关家族遗传性PD的研究发现，该基因突变会导致家族遗传性PD；并且，只有该基因发生点突变或3个以上的位点突变时，发PD疾病的概率将显著增加。该转基因动物模型会产生类PD运动症状，但有关黑质、纹状体内的神经损伤症状尚未见报到。
02Parkin✦Parkin 是泛素连接酶的一种，由PRKN基因编码。研究发现该酶失活会导致家族性与散发性 PD，且患者普遍具有早发性。现有研究已经明确了超过200个Parkin相关基因与PD具有显著相关性，且大多为隐形遗传，其遗传率不论是在纯合子生物还是杂合子生物中均高达100%。其具体作用机制为：该类基因功能障碍导致线粒体内蛋白表达紊乱，造成线粒体功能受损，引发线粒体功能障碍。敲除Parkin 相关基因的动物模型是最早使用的PD转基因动物模型之一。最新研究表明，激活Parkin 相关基因，可改善线粒体功能，恢复PD运动症状，或可治疗PD疾病。此外，Parkin 相关基因过度表达会保护黑质免受其他神经毒素作用，如 6-OHDA、病变突触核蛋白等。这一发现或为PD治疗提供新的思路。
03PINK1✦PINK1 是线粒体丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶的一种，与线粒体功能稳定性密切相关。约有 4% ～ 9%的亚洲人群和 2%～4%的白种人的早发性PD由该基因突变所致。该基因在感受线粒体相关膜电位、激活Parkin酶活性，促进损伤线粒体降解中发挥了重要作用。研究发现，PINK1 基因突变会导致常染色体隐形PD发生。该基因动物模型通常不表现出典型的PD病变—突触核蛋白沉积。而这一现象与患者剖检结果一致。此外，PINK1 基因敲除小鼠还会表现出嗅觉和步态障碍，与PD患者的前驱症状相似。因此，PINK1 敲除模型可用于研究前驱阶段的 PD。
04DJ-1✦DJ-1 基因编码的蛋白作用广泛，可参与基因转录调节、氧化应激、线粒体功能调节等活动。该基因突变会造成氧化应激反应功能紊乱，导致常染色体隐形 PD。其具体作用机制目前尚未研究清晰，该模型多用于PD基础研究。不同动物类型的该基因敲除模型具有显著差异。小鼠模型通常表现出中度运动障碍， 且未见多巴胺能神经元坏死，而大鼠模型通常会表现为黑质纹状体区域神经元坏死、缺失，并伴有运动功能障碍的临床症状。
3 转基因与神经毒素联用模型最新研究发现，上述转基因动物更容易受到神经毒素的作用， 使造模效果更为显著。例如， 将MTPT 作用于 DJ-1 缺失小鼠后，其神经元坏死、缺失更为显著，并且该模型或可为 Dual-hit 假说提供新的证据。将鱼藤酮长期作用于 α-突触核蛋白转基因小鼠可观察到PD经典三联征，即进行性运动障碍、黑质纹状体变性与 α-突触核蛋白过表达。在 α-突触核蛋白基因敲除PD啮齿动物模型中注射 6-OHDA 后，表现出黑质纹状体内大量多巴胺能神经元持续缺失与渐进性损伤，但不诱导 α-突触核蛋白过表达，可研究神经性物质与PD相关基因之间的相互作用关系。在双侧黑质纹状体内过表达 α-突触核蛋白的小鼠体内给予亚急性MPTP 后，可观察到黑质纹状体对 MPTP 的敏感性显著增加。
因此，通过联用模型，使得研究PD相关基因与神经毒素间的相互作用成为可能。不仅如此，联用模型还可以使我们更加全面地了解PD疾病所导致线粒体的具体损伤过程，展示PD相关基因与机体的相互作用，了解外界环境是如何诱发PD疾病。因此，转基因与神经毒素联用模型在研究PD 疾病作用机制中具有重要作用。总结目前为止仍然缺乏一个能完全模拟临床PD病理改变、发病症状以及病程变化的理想动物模型。目前帕金森病实验动物模型的种类繁多，表现出的帕金森病症状程度及病理改变各不相同，各种动物模型都有各自的优点与不足，因此可根据实验目的不同选择相应的模型。随着帕金森病发病机制的研究逐渐深入，相信帕金森病动物实验模型的建立将会日益完善。

来源：杨东明,杨利峰,赵德明,周向梅.帕金森病动物模型的研究进展[J].中国实验动物学报,2020,28(03):397-404.