引物合成和纯化的知识分享

        目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

1. 固相亚磷酰胺三脂法合成引物的具体步骤如下：

        1) 用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

        2) 将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；

        3) 由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；

        4) 在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

        经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？

        主要是合成过程中产生的少量失败片段。 

3. 引物纯化方式有哪些

        目前引物常用的纯化方式有：C18脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

4. 引物纯化方式如何选择？

        一般采用RPC、ePAGE纯化、PAGE、HPLC四种纯化方式，在选择上主要根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定，表2即从引物长度的角度总结了以上每一种纯化方法的适用范围。可根据实验需要，选择合适的引物纯化方式。

5. 合成的引物5'端是否有磷酸化？

        合成的引物5'端为羟基，没有磷酸基团。如果需要，可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者合成时直接在5'或3'端进行磷酸化。

6. 最长可以合成多长的引物？

        引物越长，出现问题的概率就越大。除非有特殊需要，我们建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长引物的百分比不会超过40%，后续处理还会丢失很多，因此最后的产量很低

7. 为何长链引物的收费比短链引物要高？

        在合成长链引物时，所需要的试剂比短链引物要多，回收值也相对低一些，尤其是长度大于90base的引物。由于成本的增加，从而导致价格升高。

 

8. PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？

        多数情况是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，可以：

        1) 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能。

        2) 重新合成引物。

9. 测序发现引物有突变是怎么回事？

        引物合成是一种多步骤的化学反应，每一步的合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。链越长，突变的频率累加起来就越高。在PCR扩增后克隆测序的时候，为了节约时间和提高成功率，建议：

      1)在检测到阳性克隆后准备2~3个阳性克隆子的菌液，尽量送测2个或以上克隆，这样成功率将大大提高，也节约很多时间；

      2)也可以先送测1个克隆，其余两个克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出现个别点突变或缺失，立即将余下的两个克隆送测；

      3）这样得到正确的序列可能性将非常高，并且可以免去重新PCR、连接、克隆以及筛选的一系列实验操作，更省去了很多时间。

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