化学遗传学—实现神经元调控的又一重要工具

  上两期我们介绍了神经科学实验的一大神器—光遗传学技术及其应用，感兴趣的小伙伴可以往前查看了解。本期将给大家介绍与光遗传学技术类似、也是神经研究中的一项热门技术，即化学遗传学技术（Chemogenetic）。

       化学遗传学是化学与遗传学相结合的一门技术，通过小分子化合物与配体依赖性受体相互作用，激活受体及其下游信号，进而激活或抑制细胞活动。化学遗传学的起始发展还稍早于光遗传学，自上世纪90年代至今，已有多种生物大分子被开发改造用以识别特定的小分子配体，这些生物大分子包括核酸杂交物、激酶、多种代谢酶和G蛋白偶联受体（GPCR）。其中基于GPCR的化学遗传学平台较为常用，包括等位基因特异性激活的基因编码受体（allele-specific activation of genetically encoded receptors）、仅由合成配体激活的受体（receptors activated solely by synthetic ligands，RASSLs）以及仅由设计药物激活的设计受体（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs）等工程化受体。DREADDs是目前应用最广泛且效果最好的一种化学遗传学技术，可用于控制细胞信号和神经元活动等。

DREADDs

      DREADDs由CNO（氯氮平-N-氧化物）特异性激活，引起各种GPCR级联信号传递。GPCRs是由细胞外配体（如神经递质、激素等）激活的一种细胞表面受体，它与异源三聚体G蛋白相结合，G蛋白分别由α、β和γ亚基组成，其中Gα亚基又有四种不同的亚型（Gs、Gi、Gq和G12）。当GPCRs与配体结合后，会激活G蛋白，Gα亚基则从三聚体中解离，进入胞浆激活下游信号腺苷酰环化酶(AC)或酶磷脂酶C(PLC)，由不同的Gα亚型产生不同生物学效应。在DREADDs中常使用Gq和Gi这两种亚型偶联的受体。

图1 基于人毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAchR）的DREADDs[1]

（1）Gq-DREADDs

Gq-DREADD是由人毒蕈碱乙酰胆碱受体M3（hM3）经定向改造而来的，在hM3中引入Y3.33C和A5.46G两个点突变，该突变体成为hM3Dq。hM3Dq表现出对CNO的选择性结合，同时对内源性乙酰胆碱不敏感，且未激活状态的活性水平很低。一般情况下，Gq-DREADD受体即指hM3Dq，这是使用最为广泛的兴奋性DREADDs。在神经元中，激活hM3Dq可以使神经元发生去极化并增强它们的兴奋性；另外也可以使其他细胞类型的活跃度。值得注意的是，失活状态的hM3Dq不会增加目的细胞的基础活性。

（2）Gi- DREADD

       在所有已知的mAchR中有两个保守位点Y3.33和A5.46，Gi- DREADD也是在这两个位点进行了突变，构建M4 mAchR的Y3.33C和A5.46G突变体，并命名为hM4Di。hMD4i可以在配体的结合下激活Gi介导的细胞信号。GPCR偶联的Gi可以激活G蛋白内向整流钾通道（GIRK），诱导神经元发生超极化、抑制其放电，使神经元活动受抑制。

DREADDs选择性配体CNO

CNO是FDA批准上市药物-氯氮平的代谢产物，体内应用相对安全。作为非典型的治疗精神疾病的药物氯氮平的代谢物，CNO在啮齿类动物中没有生物活性，缺少与中枢神经系统的亲和力。CNO在正常情况下与GPCR结合后启动磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞内钙离子三条信号通路。CNO广泛应用于培养神经元以及小鼠和大鼠。对动物实验而言，CNO可以使用注射的方式，也可以将其掺在食物或者饮用水中，而后者对于长期实验更加方便，可以避免注射时人为因素的影响。但是这种方式很难控制CNO 的摄取率。CNO会引起一些副作用包括低血压、镇静、抗副交感神经综合征。但是，只要药物浓度尽量低，而且设置必要的对照动物（检测无关蛋白，如GFP），这些副作用可以被忽略。

一般实验方法

1. 根据实验目的，确定合适的DREADDs受体：激活神经元活性，选择hM3Dq；抑制神经元的活性，则选择hM4Di；

2. 将遗传信息导入到动物体内：一般通过病毒注射或者转基因动物的方式将遗传信息传递给靶细胞；结合AAV的特异性血清型和启动子，可以很好地将DREADDs递送到目的组织或细胞；

图2 以AAV为载体向靶细胞递送DREADDs受体[2]

 表1. 汉恒化学遗传学AAV工具

3. 可控性演示：即通过控制CNO的给药时间，实现对细胞神经元活动的控制；

4. 实验方法的有效性验证：一般采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化，以此来验证DREADDs受体的有效性；

5. 表型检测：通过实验确认激活或者抑制神经元活动给实验动物带来的影响。

       以上则是化学遗传学技术的基本内容，如果有感兴趣的小伙伴可以进一步与我们沟通联系，汉恒将为您提供优质的病毒载体和服务。下期小编将通过实际案例给大家分享下化学遗传学的应用，敬请期待。

参考文献：

[1] Meister J, Wang L, Pydi SP, Wess J. Chemogenetic approaches to identify metabolically important GPCR signaling pathways: Therapeutic implications. J Neurochem. 2021 Aug;158(3):603-620.

[2] Urban DJ, Roth BL. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;55:399-417.