Development and Validation of a TNF Family-Based Signature for Predicting Prognosis, Tumor Immune Characteristics, and Immunotherapy Response in Colorectal Cancer Patients

摘要：

在这项研究中，对结直肠癌 (CRC) 中的 TNF 家族成员进行了全面分析，并生成了基于 TNF 家族的特征 (TFS) 来预测预后和免疫治疗反应。使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库中516例CRC患者的表达数据，采用单变量Cox比例风险回归和最小绝对收缩和选择算子-（LASSO-）Cox比例筛选TNF家族成员构建TFS。危害回归法。然后在元基因表达综合 (GEO) 队列中验证 TFS ( n= 1162) 来自 GEO 数据库。此外，分析了基于 TFS 的风险亚组中的肿瘤免疫特征和对免疫检查点阻断的预测反应。八个基因（TNFRSF11A、TNFRSF10C、TNFRSF10B、TNFSF11、TNFRSF25、TNFRSF19、LTBR 和 NGFR）用于构建 TFS。与高危患者相比，低危患者的总生存期更好，这一点得到了 GEO 数据的验证。此外，高 TFS 风险评分与调节性 T 细胞 (Tregs)、非活化巨噬细胞 (M0)、自然杀伤细胞、免疫逃逸表型、免疫治疗反应差以及致瘤和转移相关途径的高浸润有关。相反，低 TFS 风险评分与静息 CD4 记忆 T 细胞和静息树突状细胞的高浸润有关，免疫逃逸表型很少，对免疫治疗的敏感性高。因此，基于 8 个基因的 TFS 是预测 CRC 预后、免疫特征和免疫治疗反应的有希望的指标，我们的结果也为 TNF 家族成员在 CRC 预后和治疗中的作用提供了新的认识。

结果

CRC中预后TNF家族基因的鉴定

评估了 47 个定义明确的 TNF 家族基因，包括 18 个 TNFSF 成员和 29 个 TNFRSF 成员。首先，对 TCGA 队列中 516 例 CRC 病例的 TNF 家族基因表达数据进行单变量 Cox 比例风险回归分析。这些 CRC 患者的临床特征列于表格1. 9 个基因被确定为与 OS 显着相关（P < 0.1）（表 2）。在这9个基因中，风险比> 1的4个（TNFRSF25、TNFRSF19、LTBR和NGFR）被确定为危险因素，而风险比<1的其他5个（TNFRSF11A、TNFRSF10C、TNFRSF10B、TNFSF11和FAS）被确定为危险因素。被确定为保护因素。

使用 TCGA 队列中的 CRC 患者建立 TFS

为了建立最佳 TFS（风险模型），对九个基因进行 LASSO-Cox 回归分析（图1)，这导致建立了涉及 8 个 TNF 家族成员的以下公式：TFS 风险评分 = (-0.1344 × TNFRSF10B 表达) + (0.2647 × LTBR 表达) + (-0.1953 × TNFRSF10C 表达) + (0.1843 × TNFSF11 表达) + (0.1764 × TNFRSF19 表达) + (0.0916 × NGFR 表达) + (-0.1395 × TNFRSF11A 表达) + (0.1387 × TNFRSF25 表达) (图1）。此后，根据上述公式计算每位患者的 TFS 风险评分。计算出最佳截止值 (1.72)，随后将患者分为高风险 ( n = 246) 和低风险 ( n = 270) 亚组。TCGA 队列中 CRC 患者的基因表达谱、TFS 风险评分和生存状态显示在图 2(a).

Kaplan-Meier 生存分析显示高危组的 OS 较低（图 2(b)P < 0.00001) 低于低风险组。接下来，计算受试者工作特征 (AUC-ROC) 曲线值下的时间相关面积，以评估 TFS 预测 TCGA 队列中 1 年、3 年和 5 年 OS 的能力。这些值分别为 0.704、0.703 和 0.665（图 2(c)）。由于早期（I 期和 II 期）和晚期（III 和 IV 期）CRC 的治疗策略和预后存在显着差异，因此 TFS 被进一步应用于这些不同的临床阶段。高危组晚期患者的 OS 比低危组差（图 2(e))（对数秩检验，P < 0.0001）

在四个独立队列和 Meta-GEO 队列中验证 TFS

为了评估八基因 TFS 的预后稳健性，使用相同的风险公式进一步评估其在四个独立 GEO 数据集（GSE17536、GSE39582、GSE17537和GSE87211）和元 GEO 队列中的表现。根据最佳 TFS 风险评分截止值，验证队列中的患者被分为高风险组和低风险组。Meta-GEO 队列中 TFS 中 8 个基因的 mRNA 表达、生存状态和 TFS 风险评分显示在图 3(a). 正如预期的那样，Kaplan-Meier 结果显示，在GSE17536数据集中，与低风险组相比，高风险患者的 OS 更差（截止值 = -0.43；对数秩检验，P = 0.0121）（图 3(c)），在GSE39582数据集中（截止值 = -0.2；对数秩检验，P = 0.2372）（图 3(d)), 在GSE17537数据集中 (cutoff = 0; log-rank test, P = 0.0169) (图 3(e))，并且在GSE87211数据集中 (cutoff = -0.02; log-rank test, P = 0.3026) (图 3(f)）。由于上述四个独立数据集中的两个P > 0.05，因此在元 GEO CRC 队列中进一步评估了 TFS 的预后价值。结果表明，TFS 对 CRC 患者具有较高的预测能力（截止值 = -0.2；对数秩检验，P < 0.001）（图 3(b)）。

评估高风险和低风险人群的免疫细胞浸润和 TME

为了评估与两个 TFS 风险亚组相关的免疫细胞浸润，对 TCGA 队列中的每个 CRC 病例使用 CIBERSORT 和 LM22 来评估 22 个免疫细胞的比例。图 4(a)）。低风险组的静息 CD4 记忆 T 细胞和静息树突状细胞浸润较高，而调节性 T 细胞 (Tregs)、非活化巨噬细胞 (M0)、活化自然杀伤 (NK) 细胞和中性粒细胞浸润较高高危组 ( P < 0.001) (图 4(b)）。此外，采用 ESTIMATE 算法评估低风险组和高风险组 CRC 患者的 ESTIMATE 评分、基质评分、免疫评分和肿瘤纯度的差异。我们发现 TFS 与 ESTIMATE 评分和免疫评分呈负相关，而 TFS 与基质评分和肿瘤纯度

TFS 与免疫治疗反应之间的关联

由于 TFS 成功预测了 CRC 患者的 OS 率，我们进一步研究了其对免疫治疗反应的预测能力。

首先，TFS与免疫检查点蛋白的相关性分析，包括CTLA4、PD-1、PD-L1、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）、T细胞免疫球蛋白和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域（TIGIT），和 T 细胞免疫球蛋白 3 (TIM-3)，在 TCGA 数据集中的 516 名 CRC 患者中进行。TFS 与这些免疫检查点蛋白呈负相关（P < 0.01），但 LAG-3 与 TFS 无关（P > 0.05）（图5(c) 和 5(d)）。

此后，应用 TIDE 算法来预测对 ICB 的反应。有趣的是，高风险组的 TIDE 评分、T 细胞功能障碍 (Dysfunction)、T 细胞排斥 (Exclusion) 和髓源性抑制细胞 (MDSC) 的值显着更高。相比之下，高危组的干扰素-γ (IFNG)、MSI 评分、Merck18、CD274 和肿瘤相关巨噬细胞 M2 值显着降低（Mann-Whitney U检验P < 0.001）（图5(a) 和 5(b)）。最后，我们分析了高危和低危患者肿瘤突变负荷（TMB）的差异，未发现显着差异（图 5(e)）。

高风险和低风险群体之间的DEG的功能丰富性分析

根据log2绝对值（倍数变化（FC））≥1和FDR <0.05的标准，在高风险组和低风险组之间确定了127个DEG。其中，高危组74个基因上调（log2FC>1），53个基因下调（log2FC<1）。随后，对 127 个 DEGs 进行 GO 和 KEGG 分析，以进一步了解与这些基因相关的生物学功能和信号通路。GO分析表明，DEGs主要富集于以下GO生物学过程：消化系统发育、O-聚糖加工、激素代谢过程和白细胞趋化性调节。DEGs的GO分子功能包括脂质转运蛋白活性、丝氨酸型内肽酶活性、受体配体活性、粒细胞趋化性的正调节、和生长因子活性。主要富集的 GO 细胞成分是膜的锚定成分（图 6(b)）。KEGG 通路分析表明，DEGs 与过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K-) Akt、白细胞介素- (IL-) 17、Wnt 信号通路和细胞外基质- (ECM- ）受体相互作用，已被证实与癌症的发生和进展有关（图 6(c)) [ 22 – 26 ]。这些生物学功能和途径可能有助于 DEG 在 CRC 发展中的作用。

基于 TFS 的列线图

为了评估 TFS 是否可以独立预测 CRC 预后，对传统的临床重要因素和八基因 TFS 进行了单变量和多变量 Cox 回归分析。根据单变量 Cox 回归，年龄、肿瘤、淋巴结、转移 (TNM) 分期和 TFS 与较差的 OS 显着相关。图 7(a)）。随后的多变量 Cox 回归显示，TNM 分期和 TFS 都是 TCGA 队列中 CRC 患者的独立预后因素。图 7(b)）。为了在临床实践中提供预测 CRC 患者预后的定量工具，构建了一个整合了 8 基因 TFS 和 TNM 分期的列线图。图 7(c)）。此外，列线图的校准曲线表明它对预测患者的 1 年、3 年和 5 年 OS 具有良好的效果（图7(d)–7(f)）。

讨论

据我们所知，这是第一次构建 TFS 来预测 CRC 患者的预后和免疫治疗反应。使用单变量 Cox 比例风险回归分析和 LASSO-Cox 比例风险回归分析，确定了 CRC 的八基因 TFS，并使用 GEO 数据对其进行了验证。TFS 被发现是 CRC 患者 OS 差的独立危险因素。我们还研究了高危和低危患者的免疫特征，发现 TFS 与各种肿瘤浸润免疫细胞密切相关。此外，TFS 与几种免疫治疗反应生物标志物呈负相关，包括 PD-L1、PD-1、CTLA4、TIGIT 和 TIM-3。这表明肿瘤免疫逃逸可能导致高危CRC患者的不良预后。

系统分析了CRC患者中TNF家族成员的基因表达谱。结果，8个基因（TNFRSF10B、LTBR、TNFRSF10C、TNFSF11、TNFRSF19、NGFR、TNFRSF11A和TNFRSF25）用于建立TFS。TNFRSF10B（也称为 DR5 或 TRAILR2）是一种属于 TNFRSF 家族的蛋白质，可介导各种癌细胞的外在凋亡途径 [ 27 ]。最近的研究表明，这种蛋白质在人类 CRC 细胞中的上调提高了癌症治疗的效率 [ 28 – 30 ]。淋巴毒素-β 受体（LT β R 或 LTBR）是 TNFRSF 家族的成员，它可能参与促进 CRC 的细胞增殖[ 31]。TNFRSF10C属于TNFRSF家族，可与TNF相关的凋亡诱导配体样（TRAIL）结合，抑制细胞内凋亡信号通路。此外，这种蛋白质的下调会加重远处 CRC 转移 [ 32 ]。TNFRSF19（也称为 TROY）是 TNFRSF 家族的成员，在原发性 CRC 中上调，导致 CRC 的发生或进展 [ 33 ]。NGFR 属于 TNFRSF 家族，已被证明直接或间接参与 CRC 的发展和转移 [ 34 ]。尽管 TNFSF25、TNFRSF11A 和 TNFRSF11 的预后价值之前尚未在 CRC 中进行过研究，但它们仍有可能用作新的生物标志物。

最近，TME 中的肿瘤浸润性免疫细胞因其在调节癌症进展和预测癌症结果方面的重要作用而受到越来越多的关注 [ 35 ]。在这项研究中，进行了免疫细胞浸润分析以比较低风险组和高风险组之间的炎症状态。我们发现高危 CRC 患者的 Treg 细胞、非活化巨噬细胞 (M0) 和 NK 细胞比例较高。Treg 细胞是 CD4+ T 细胞的一种亚型，对维持免疫稳态至关重要，并参与肿瘤免疫逃逸，从而促进肿瘤的发展和进展 [ 36]。同样，肿瘤相关巨噬细胞是 TME 的重要组成部分，通过促进免疫逃逸在肿瘤发生和进展中发挥作用 [ 37 ]。尽管 NK 细胞被认为是先天免疫和肿瘤免疫监视中的主要效应细胞 [ 38 ]，但 NK 细胞的高浸润与某些肿瘤的不良预后有关，这可能是因为肿瘤相关的巨噬细胞、单核细胞和其他免疫细胞细胞损害其功能 [ 39 , 40 ]。

此外，我们调查了基于 TFS 的风险亚组与几种免疫治疗反应生物标志物之间的关联，包括免疫检查点蛋白和 TIDE 评分。正如预期的那样，高危 CRC 患者的 PD-L1、PD-1、CTLA4、TIGIT 和 TIM-3 表达普遍较低。结果表明，高危患者对 ICB 的反应可能较差 [ 41 ]。TIDE 评分作为预测 ICB 反应的传统单一生物标志物的有效替代品。较高的 TIDE 评分不仅表明肿瘤具有免疫逃逸表型，而且还预示着癌症患者对 ICB 的反应较差 [ 21 ]。此外，IFNG、MSI 评分和 CD274 值的增加表明对 ICB 的反应良好 [ 42]。我们发现高危组 CRC 患者的 TIDE 评分、T 细胞功能障碍和 T 细胞排斥为阳性，而 IFNG、MSI 评分和 CD274 为阴性。综上所述，这些结果表明高危CRC患者预后不良是由于肿瘤免疫逃避和对ICB反应差，这有助于肿瘤侵袭和转移。

免疫评分总结了侵袭边缘和肿瘤核心处 CD3+ 和 CD8+ T 细胞效应物的密度 [ 43 ]。据报道，它在预测 CRC [ 44 ] 中的 OS 方面优于 TNM 分类。先前的研究报道，与免疫评分低的患者相比，免疫评分高的 CRC 患者的复发风险最低且 OS 更好 [ 43 , 45 ]。因此，我们的结果表明，高危组患者的免疫评分较低，这进一步验证了 TFS 的可靠性。

然而，该研究有一些需要注意的局限性。首先，本研究中的数据来自 TCGA 和 GEO 数据库，结果应进一步进行临床验证，以评估 TFS 在临床环境中预测 CRC 患者预后的稳健性。其次，没有评估 TFS 对具有各种临床特征（如高脂饮食、饮酒、焦虑和抑郁）的患者的预测能力。然而，这些因素有助于 CRC 的发生和进展以及患者的不同预后 [ 46 , 47 ]。第三，由于没有来自接受免疫治疗的患者的基因表达数据，需要前瞻性研究来确认 TFS 预测免疫治疗反应的能力。

总之，这是第一项为 CRC 患者确定和验证可靠、临床上可行的 TFS 的研究，该研究对这些患者的临床结果和免疫治疗反应具有独立的预测价值。