生物制药综合实验（重组质粒模块）实验三 重组表达载体pEasy E1-gfp的转化

实验目的：

1. 掌握大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌的原理；

2. 了解制备感受态细胞的方法及原理；

3. 掌握转化大肠杆菌的方法

实验原理：

转化（transformation）是将外源DNA分子导入受体细胞使后者获得新的遗传性质的一种方法。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的突变株，不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-），外源DNA分子在受体细胞内不会被降解，可以稳定的遗传给后代。宿主细胞经过电转化、CaCl2等处理之后，其细胞膜的通透性发生暂时的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（competent cells）。

本实验中使用的受体细胞为大肠杆菌BL21（DE3）菌株，该菌株用于表达克隆于含T7噬菌体启动子的表达载体上的基因，如pET、pGEX系列表达载体。BL21（DE3）菌株的染色体BL21区上整合了λ噬菌体的DE3的DNA片段，该片段含有编码T7 RNA聚合酶的基因，该基因受lac UV5启动子控制。当整合有外遇基因的pET重组载体进入BL21（DE3）细胞后，无T7 RNA聚合酶结合于T7启动子；当用IPTG诱导后，解除了lac UV5启动子的阻遏，表达出T7 RNA聚合酶并结合在载体的T7启动子上，启动外源基因的转录和表达。

实验材料：

1、试剂：实验二的连接产物（pEasy E1-gfp），LB培养基，氨苄青霉素；

2、菌株：大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞；

3、实验器具：制冰机、水浴锅、培养箱、酒精灯。

实验步骤：

1、将实验二的连接产物（pEasy E1-gfp）与刚融化的大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞温和混匀，冰浴30min；

2、感受态细胞混合物转至42℃热激90sec后冰浴10min；

3、加入300μl LB培养基，37℃，200rpm培养1小时；

4、4000rpm离心2min，取200μl，弃之；剩余培养物温和混匀后涂布于含AMP的LB固体平板上，37℃培养12h。