原代细胞培养分离注意事项

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养的细胞统称为原代细胞。一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

原代细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA）处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
常见的原代细胞类型：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、神经元、星形胶质细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、滑膜细胞、毛细胞、血细胞、干细胞。

原代细胞分离注意事项1.组织块培养法（1）组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。（2）加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。（3）当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。（4）为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

2.贴壁型原代细胞

（1) 原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

（2）适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

（3）尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

3.悬浮型原代细胞

(1）必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

(2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

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