如何鉴定敲除细胞系是否构建成功
常见的CRISPR-Cas9系统,是基于gRNA与目的基因互补配对将其锚定在Cas9蛋白的特定结构域上,RuvC 的结构负责非互补链的切割,切割的位点位于 PAM 的 5’端的第三个碱基 外侧,而中部类似于 HNH 的结构负责互补链的切割,从而实现基因片段的敲除。
常用的CRISPR-Cas9系统电转方法是将 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育结合为 RNP,电转到靶细胞中,进行双 sgRNA 片段敲除。或者可采用质粒或病毒转导将双sgRNA与 Cas9 基因构建在同一载体中使其转导入目的基因所在的细胞中,实现片段敲除。
技术原理图


初步鉴定敲除细胞系是否构建成功,需鉴定其DNA水平。片段敲除可有如下的鉴定策略(图1)。设计引物PCR扩增三个区域,分别为gRNA-A1作用的区域(Region 1蓝色框区域, gRNA-A2作用的区域(Region 2绿色框区域)和敲除区域(Region 3 黑色框区域)。如果gRNA作用的区域无法扩增出条带,而完整的敲除区域扩增出比野生型小的条带,则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。
PCR鉴定位点如下图


Region 1 (WT:643 bp; 杂合子:643 bp; 纯合子: 0 bp)

Region 2 (WT:958 bp; 杂合子:958 bp; 纯合子: 0 bp)

Region 3 (WT:5577 bp; 杂合子:5577/~637 bp; 纯合子: ~637 bp)


作者:Cas9x海星生物
公众号:海星生物科技
以上内容由海星生物(http://www.cas9x.com)提供
我们的服务:CRISPR/Cas9细胞基因编辑、载体构建/病毒包装、分子诊断标准品/突变基因标准品/融合基因标准品、细胞稳转/细胞干扰
我们的产品:HyCyte干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、ClonePlus 专用培养基、基因编辑试盒、病毒现货、细胞专用血清