去泛素化酶USP13稳定抗炎受体IL-1R8/Sigirr以抑制肺部炎症

写在前面

        今天推荐的是由美国俄亥俄州立大学戴维斯心肺研究所生理学和细胞生物学系在2019年7月1日发表于EBioMedicine（2020IF：8.143，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Yutong Zhao教授，研究表明去泛素化酶USP13稳定抗炎受体IL-1R8/Sigirr以抑制肺部炎症。

研究背景

        白细胞介素-1（IL-1）相关受体（Sigirr），也被称为IL-1R8，已被证明对包括急性肺损伤在内的炎症性疾病有广泛的抗炎作用，而IL-1R8/Sigirr蛋白稳定性的分子调控尚未有报道。本研究旨在研究一种去泛素化酶（DUB）对IL-1R8/Sigirr的稳定是否足以抑制炎症反应和减轻肺部炎症。

摘要部分

        作者发现IL-1R8/Sigirr的降解是由泛素-蛋白酶体系统通过位点特异性泛素化介导的。这种作用被USP13所抑制。USP13的水平与IL-1R8/Sigirr直接相关，这两种蛋白在受TLR4激动剂脂多糖（LPS）炎症损伤的小鼠的细胞和组织中都有所减少。细胞中的USP13被敲低后，IL-1R8/Sigirr的多泛素化增加，其稳定性降低，这增强了LPS诱导的TLR4信号传导和细胞因子的释放。同样，USP13缺陷的小鼠对LPS或铜绿假单胞菌模型的肺部炎症损伤高度敏感。IL-1R8/Sigirr在细胞中的过表达或通过肺部病毒转染降低了USP13-/-基因型导致的炎症表型。

研究内容

1.Sigirr在蛋白酶体中被降解       

        IL-37已被确定为Sigirr的唯一配体。作者测试了IL-37是否会调节Sigirr的丰度。用IL-37处理MLE12小鼠肺上皮细胞或人巨噬细胞，结果发现Sigirr总蛋白水平下降，但IL-18R1没有下降。用抗Sigirr抗体的流式细胞仪分析显示，IL-37随着时间的推移降低了其在细胞表面的丰度。这些结果表明，Sigirr被IL-37内化和降解是研究Sigirr降解的分子机制的一个合适的分子模型。为了研究蛋白酶体或溶酶体途径是否参与了Sigirr的降解，作者在IL-37处理前用蛋白酶体（MG-132）或溶酶体活性的抑制剂（leupeptin）孵育MLE12细胞。MG-132，但不是leupeptin，阻止了Sigirr的降解，表明Sigirr降解不发生在溶酶体中。此外，Sigirr在蛋白合成抑制剂环己酮（CHX）存在下的半衰期被MG-132延长，进一步表面蛋白体降解是细胞Sigirr消除的主要途径。

    多泛素化可以通过 Lys (K)48-、K63-和其他泛素链连接来表征，作者发现K48而非K63连接的泛素链是Sigirr修饰的主要模式。泛素链通常被添加到底物蛋白的赖氨酸残基上。为了确定Sigirr内的泛素接受点，作者用精氨酸替换了人类Sigirr的几个K残基。这些K-R突变确定了Sigirr的K163残基是IL-37介导的推定泛素受体残基，因为与WT或其他Sigirr的K-R突变体相比，SigirrK163R没有被降解，并显示泛素化的减少。

研究结论：Sigirr可以被K48连接的泛素链在K163残基上泛素化，以响应IL-37的连接，导致其蛋白体降解。

2.USP13去泛素化并稳定Sigirr

        由于DUBs去除泛素链，它们可以抑制降解信号以稳定底物蛋白。作者进行了一个筛选，以确定负责稳定Sigirr的DUB。只有V5标记的USP13的异位表达明显减少了Sigirr的降解。三种针对小鼠USP13 mRNA的shRNA有效地将Sigirr蛋白水平降低了约70-90%，同样，人类USP13 siRNA也将BEAS-2B人类上皮细胞中的Sigirr蛋白降低了约80%。敲低USP13并不影响Sigirr mRNA转录水平，表明USP13稳定Sigirr蛋白而不改变其基因表达。USP13-V5的过量表达削弱了MLE12细胞中的Sigirr泛素化，而用shRNA敲低USP13增强了Sigirr泛素化，表明USP13对Sigirr进行去泛素化以稳定该蛋白。

研究结论：USP13去泛素化并稳定Sigirr。

3.USP13与Sigirr相关

        接下来，作者使用免疫荧光染色评估了USP13-Sigirr 关联。MLE12细胞与HA标记的Sigirr和USP13-V5共转染。Sigir-HA和USP13-V5高度共定位于细胞膜内侧，在细胞质中也观察到一些斑点。Co-IP还揭示了USP13与Sigirr的关联。DUB 和跨膜受体蛋白之间的关联可以通过连接进行调节。USP13和Sigirr的复合物在IL-37处理后被破坏，表明IL-37通过减少其与USP13的结合来增加Sigirr泛素化。为了进一步鉴定 Sigirr上的USP13结合区域，作者将纯化的USP13-HA与一系列Sigirr-V5 的C端缺失突变体一起孵育。Co-IP分析显示SigirC端的290-374aa区域是其与USP13结合所必需的。

研究结论：USP13与Sigirr有相互作用。

4.USP13通过稳定Sigirr抑制LPS诱导的炎症反应

        为了研究USP13在炎症反应中的生物学功能，作者首先证实了Sigirr的抗炎活性。Sigirr的过量表达削弱了LPS诱导的JNK、ERK和IL-6基因表达的磷酸化。LPS诱导NF-κB和MAPK信号以介导炎症信号和细胞因子的释放。USP13的过量表达削弱了LPS诱导的I-κB的磷酸化和降解、p38的磷酸化，以及LPS诱导的RAW 264.7细胞中IL-6的释放。用shRNA或siRNA下调USP13可以促进LPS诱导的I-κB的磷酸化和降解、p38的激活、NF-κB p65亚基的核转位和IL-8的释放。为了确定USP13对LPS信号的抑制作用是否取决于其活性，作者在293TLR4细胞中过量表达了USP13的无催化活性突变体（C345A）。USP13 C345A没有减弱LPS诱导的p38的磷酸化，而是增加了p38的磷酸化，这表明USP13的酶活性是抑制LPS信号传导所必需的。

研究结论：USP13在LPS处理的细胞中表现出抗炎活性。

5.USP13因体外和体内内毒素处理而减少

        LPS诱导后，在RAW 264.7细胞和MLE12细胞中，USP13和Sigirr都随着时间的推移而被降低。在小鼠急性肺损伤模型中，气管内用LPS或铜绿假单胞菌（PA103菌株）处理后，小鼠肺部匀浆中的USP13和Sigirr水平也同样下降。免疫组化染色显示，肺上皮细胞中的USP13减少，这与H&E染色和IL-1β丰度显示的炎症损伤增加相关。这些数据表明，USP13在急性炎症损伤期间是下调的。作者评估了LPS诱导的USP13下调的可能分子机制，并观察到USP13 mRNA水平被LPS降低，表明LPS刺激减少了USP13的转录。作者随后测试了几个下游途径，对NF-κB、JNK和p38途径的药物阻断并不影响LPS介导的USP13的减少。

研究结论：内毒素处理能够在体内和体外诱导USP13蛋白水平降低。

6.Usp13 缺陷小鼠加剧LPS或铜绿假单胞菌诱导的肺部炎症

        为了研究USP13在炎症反应中的相关性，作者使用CRISPR/Cas9生成Usp13缺陷小鼠。作者发现来自Usp13-/- 小鼠的肺组织裂解物中有接近USP13分子量的微弱条带，可能来自未发现的 Usp13 剪接突变体。与作者的细胞 USP13 敲低研究一致，来自 Usp13-/-小鼠的肺中的Sigir水平显着减少。作者假设 Usp13-/-小鼠会表现出增强的炎症，作者通过气管内施用LPS或铜绿假单胞菌（PA103 菌株）对 Usp13-/-小鼠或 Usp13+/+ (WT) 小鼠进行测试。与 WT 小鼠相比，Usp13-/- 小鼠LPS处理后6小时或铜绿假单胞菌感染后4小时，USP13-/-小鼠表现出明显更大的细胞浸润，尤其是中性粒细胞。H&E 染色显示，小鼠的炎症损伤增加，并且BAL液中TNF-α、IL-1β和IL-6释放增加。这些数据表明，USP13的缺失促进了肺损伤小鼠模型中的肺部炎症。

研究结论：炎症环境中USP13的减少可能在一定程度上促成了肺损伤的发病机制。

7.Sigirr在Usp13-/-小鼠中逆转LPS诱导的急性肺部炎症

        为了研究在Usp13-/-小鼠身上观察到的炎症增强是否是由于Sigirr的失调,作者构建了Sigirr的慢病毒载体，并注射到WT或Usp13-/-小鼠的气管内，五天后用LPS注射小鼠。Western blot证实了Sigir在Lenti-Sigirr感染的小鼠肺部组织中的表达。Lenti-Sigirr转导有效地抑制了Usp13-/-动物中观察到的增强的LPS诱导的肺部炎症表型，细胞浸润和中性粒细胞、TNF-α和IL-1β减少。

研究结论：由USP13耗竭引起的促炎症反应的增强，部分是由于Sigirr的不稳定。

结论与讨论

        总之，作者提出了一个以USP13作为Sigirr稳定性的正向调节器的工作模型，表明USP13活性有利于保持抗炎IL-37-Sigirr活性，同时炎症期间两种蛋白质的丰度降低。USP13去泛素化酶活性逆转Sigirr多泛素化，并稳定Sigirr蛋白以保留抗炎信号。基于这些信息，可以通过增强USP13活性来稳定Sigirr，这可能是阻止肺部炎症的有效策略。

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原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.011